El uso de nuevas técnicas rápidas para el diagnóstico de virus respiratorios permite optimizar el manejo clínico de los pacientes, evita el uso innecesario de antibióticos y permite la adopción de medidas para evitar la trasmisión viral. Si bien no es posible ni necesario realizar diagnóstico virológico en todos los pacientes, el uso de estas técnicas también posibilita realizar una vigilancia que permite conocer cuales son los virus circulantes en un período dado, proporcionando una base epidemiológica que permite realizar diagnósticos clínicos más precisos.
El diagnóstico etiológico de virus influenza se realiza a partir de una muestra de hisopado nasofaríngeo o un aspirado nasofaríngeo. Esta muestra debe contener células suficientes que aseguren la pesquisa del virus influenza A o B.
Inmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%. Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas. Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%.
Tiempo de procesamiento de los examenes: La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.
a reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
Preparación para el examen No se necesita ninguna preparación especial.
Lo que se siente durante el examen Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil.
Razones por las que se realiza el examen Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Valores normales Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen.
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL 1. Métodos para detectar virus. 1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico. • Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple. • Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus. El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares. Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica. Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga). 1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células. 1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa. 1.4. Inmunofluorescencia directa, utilizando células del paciente, como leucocitos, orina o mucosa oral o genital, para buscar virus. 1.5. Detección de ácidos nucleicos virales por reacción de polimerasa en cadena, las cuales permiten amplificar una porción pequeña de ácido nucleico en un período de tiempo corto.
Cultivo in-vitro de tejidos de Physcomitrella patens en placas de Petri con agar. En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales. Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
Efecto citopático Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales. Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral. Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus). Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
Sincitios: Los sincitios son grupos de células fusionadas apreciables como una masa celular multinucleada. La inducción de sincitios se ha observado en la infección por VIH, en concreto por variantes virales muy patogénicas que surgen en etapas tardías de la enfermedad, por lo que tienen valor pronóstico. Igualmente, es una característica frecuente en el virus sincitial respiratorio (que lleva su nombre precisamente por este fenómeno). Su observación generalmente se ha realizado en células en cultivo, pero dicho fenómeno permite in vivo la infección de nuevos linfocitos T CD4+ sin la parte extracelular del ciclo, en la que son más vulnerables a la respuesta humoral.
Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Fundamento e importancia
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980. Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).
Termociclador: aparato en el que se efectúa la PCR convencional. Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos carecían de este sistema y solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos. Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación. Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
El mayor inconveniente de la prueba es el hecho de que otros componentes del suero de los pacientes, además de los anticuerpos, pueden a su vez inhibir la hemaglutinación, se denominan inhibidores inespecíficos los cuales deben ser eliminados antes de realizar la prueba.
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:
-En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.
-En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña. -En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.
En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnostico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la técnica. 2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antígeno, el exceso dará lugar a una reacción falsa negativa. 3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubación para evitar la aparición de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo y el color no será evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo antígeno-anticuerpo tampoco se completará en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las proteínas (antígeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos. 4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.
Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.
• ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado).
• ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran variedad de antígenos, por eso es un método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión por tener un eslabón más con respecto al método directo. La dilución de la solución que contiene el anticuerpo primario (por ejemplo: suero sanguíneo) es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparición de falsos negativos, ya que si la muestra está muy diluida no saldrá positiva si la titulación de anticuerpos es muy baja. Es decir, aunque los anticuerpos están presentes, la prueba no da positivo porque la concentración de anticuerpos específicos contra el antígeno que está pegado en el fondo del pocillo no es suficiente como para dar una señal detectable.
El ELISA indirecto es el método de elección para detectar la presencia de anticuerpos séricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Según esta técnica, proteínas recombinantes de la envoltura y el núcleo del VIH se absorben como antígenos en fase sólida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos séricos contra epítopos en estas proteínas víricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos séricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infección.
• ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL 1. Métodos para detectar virus. 1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico. • Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple. • Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus. El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares. Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica. Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga). 1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células. 1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
Inmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%. Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas. Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%.
Tiempo de procesamiento de los examenes: La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
88402 3-Efecto citopático Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales. Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral. Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus). Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
88402 4-a reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
88402 5-La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos. Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación. Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
Preparación para el examen No se necesita ninguna preparación especial.
Lo que se siente durante el examen Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil.
Razones por las que se realiza el examen Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Valores normales Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen. • ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
88402 7-La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
1. Métodos para detectar virus. 1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple. • Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.
Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética,mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
Iniciación
El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas, con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza, dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán a partir del explanto original dependen de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como tallos, raíces, bulbos u otros órganos. Estos tejidos cultivados in vitro se hallan dentro de un microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico, protegidos del medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo, que pueda entrar al mismo, crecerá de forma oportunista a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos.
Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es «cultivar los tejidos», deben proveerse además ciertos requerimientos externos: los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o pueden colocarse en un medio líquido.
Los tejidos también necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y una mezcla de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares.
Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo, en general, es necesario el suministro de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio de cultivo, más que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios altos niveles de luz.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Fundamento e importancia Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980. Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas demicroorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent). Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos carecían de este sistema y solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o con un poco decera dentro de los tubos. Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
El mayor inconveniente de la prueba es el hecho de que otros componentes del suero de los pacientes, además de los anticuerpos, pueden a su vez inhibir la hemaglutinación, se denominan inhibidores inespecíficos los cuales deben ser eliminados antes de realizar la prueba.
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer: -En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo. -En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña. -En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.
En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnostico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la técnica.
2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antígeno, el exceso dará lugar a una reacción falsa negativa.
3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubación para evitar la aparición de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo y el color no será evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo antígeno-anticuerpo tampoco se completará en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las proteínas (antígeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos.
4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.
2012-0249 La virología (rama de la microbiologia) es el estudio de los virus: su estructura, clasificación y evolución, su manera de infectar y aprovecharse de las células huésped para la reproducción del virus, su interacción con los organismos huéspedes, su inmunidad, la enfermedad que causan, las técnicas para su aislamiento, cultivo y su uso en investigación y terapia. La virología es considerada un sub-campo de la microbiología y la medicina. La virologia también es una rama taxonómica de la biología para estudiar los virus y todos sus componentes. Su investigación incluye: la replicación viral los patógenos virales. la inmunología viral. las vacunas virales. los métodos de diagnóstico. la quimioterapia antiviral. las medidas de control de una infección. los diferentes signos que manifiestan la presencia de virus.
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL 1. Métodos para detectar virus. 1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico. • Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple. • Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus. El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares. Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica. Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga). 1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células. 1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
Inmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%. Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas. Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%.
Tiempo de procesamiento de los examenes: La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
Efecto citopático Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales. Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral. Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus). Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos. Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación. Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
Preparación para el examen No se necesita ninguna preparación especial.
Lo que se siente durante el examen Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil.
Razones por las que se realiza el examen Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Valores normales Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen. • ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
El uso de nuevas técnicas rápidas para el diagnóstico de virus respiratorios permite optimizar el manejo clínico de los pacientes, evita el uso innecesario de antibióticos y permite la adopción de medidas para evitar la trasmisión viral. Si bien no es posible ni necesario realizar diagnóstico virológico en todos los pacientes, el uso de estas técnicas también posibilita realizar una vigilancia que permite conocer cuales son los virus circulantes en un período dado, proporcionando una base epidemiológica que permite realizar diagnósticos clínicos más precisos.
El diagnóstico etiológico de virus influenza se realiza a partir de una muestra de hisopado nasofaríngeo o un aspirado nasofaríngeo. Esta muestra debe contener células suficientes que aseguren la pesquisa del virus influenza A o B. mat:89206
Inmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%. Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas. Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%.
Tiempo de procesamiento de los examenes: La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas mat:89206
En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.
a reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. mat:89206
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos mat:89206
Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
Preparación para el examen No se necesita ninguna preparación especial.
Lo que se siente durante el examen Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil.
Razones por las que se realiza el examen Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Valores normales Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen. mat:89206
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda mat:89206
Diapositiva1 DIAGNÓSTICO DE LAS VIROSIS Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped. DIAGNOSTICO VIRAL 1. Métodos para detectar virus. 1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico. • Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple. • Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus. El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares. Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica. Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga). 1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células. 1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa. 1.4. Inmunofluorescencia directa, utilizando células del paciente, como leucocitos, orina o mucosa oral o genital, para buscar virus. 1.5. Detección de ácidos nucleicos virales por reacción de polimerasa en cadena, las cuales permiten amplificar una porción pequeña de ácido nucleico en un período de tiempo corto.
Diapositiva2 Cultivo de tejidos vegetales Cultivo in-vitro de tejidos de Physcomitrella patens en placas de Petri con agar. En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales. Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
Diapositiva3 Efecto citopático Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones. Cambios morfológicos Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales. Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral. Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus). Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
Sincitios: Los sincitios son grupos de células fusionadas apreciables como una masa celular multinucleada. La inducción de sincitios se ha observado en la infección por VIH, en concreto por variantes virales muy patogénicas que surgen en etapas tardías de la enfermedad, por lo que tienen valor pronóstico. Igualmente, es una característica frecuente en el virus sincitial respiratorio (que lleva su nombre precisamente por este fenómeno). Su observación generalmente se ha realizado en células en cultivo, pero dicho fenómeno permite in vivo la infección de nuevos linfocitos T CD4+ sin la parte extracelular del ciclo, en la que son más vulnerables a la respuesta humoral.
Diapositiva4 Reacción en cadena de la polimerasa Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad. La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Fundamento e importancia Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980. Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent). Termociclador: aparato en el que se efectúa la PCR convencional. Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos carecían de este sistema y solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos. Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Diapositiva5 Inhibición de Hemaglutinación Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación. Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar. El mayor inconveniente de la prueba es el hecho de que otros componentes del suero de los pacientes, además de los anticuerpos, pueden a su vez inhibir la hemaglutinación, se denominan inhibidores inespecíficos los cuales deben ser eliminados antes de realizar la prueba.
Diapositiva6 Elisa ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer: -En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo. -En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña. -En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo. En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnostico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Diapositiva7 Continuación: Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes: 1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la técnica. 2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antígeno, el exceso dará lugar a una reacción falsa negativa. 3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubación para evitar la aparición de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo y el color no será evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo antígeno-anticuerpo tampoco se completará en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las proteínas (antígeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos. 4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.
Diapositiva8 Tipos de ensayos ELISA Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.
• ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado).
• ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran variedad de antígenos, por eso es un método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión por tener un eslabón más con respecto al método directo. La dilución de la solución que contiene el anticuerpo primario (por ejemplo: suero sanguíneo) es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparición de falsos negativos, ya que si la muestra está muy diluida no saldrá positiva si la titulación de anticuerpos es muy baja. Es decir, aunque los anticuerpos están presentes, la prueba no da positivo porque la concentración de anticuerpos específicos contra el antígeno que está pegado en el fondo del pocillo no es suficiente como para dar una señal detectable.
El ELISA indirecto es el método de elección para detectar la presencia de anticuerpos séricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Según esta técnica, proteínas recombinantes de la envoltura y el núcleo del VIH se absorben como antígenos en fase sólida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos séricos contra epítopos en estas proteínas víricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos séricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infección.
• ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
Caroleny Cespedes Zorrilla 87997 Diapositiva 1 Tema: Diagnostico de las virosis
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL Métodos para detectar virus.
Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico. • Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple. • Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga).
Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células. 1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
Caroleny Cespedes Zorrilla 87997 Diapositiva 2 Tema: Cultivo de los tejidos
Cultivo in-vitro de tejidos de Physcomitrella patens en placas de Petri con agar. En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales. Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
Caroleny Cespedes Zorrilla 87997 Diapositiva 3 Tema: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Fundamento e importancia
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980. Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).
Termociclador: aparato en el que se efectúa la PCR convencional. Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos carecían de este sistema y solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos. Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Caroleny Cespedes Zorrilla 87997 Diapositiva 4 Tema: Inoculaciones en el embrion del pollo
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos. Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación. Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
Caroleny Cespedes Zorrilla 87997 Diapositiva 5 Tema: Inhibicion de la hemaglutinacion
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
Preparación para el examen No se necesita ninguna preparación especial.
Lo que se siente durante el examen Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil.
Razones por las que se realiza el examen Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Valores normales Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen.
Caroleny Cespedes Zorrilla 87997 Diapositiva 7 Tema: Tecnica de blotting
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, según persigan demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos específicos por parte del huésped en el curso de la infección.
Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico clínico se basan en pruebas serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas. Sin embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten precozmente la infección viral (tratamientos específicos, medidas profilácticas, etc.).
En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia de antígenos virales previamente al desarrollo de la seroconversión, siendo esta prueba la única evidencia de la exposición al virus cuando no existe aumento de los niveles de anticuerpos circulantes (pacientes inmunodeprimidos).
Igualmente la detección del genoma viral puede favorecer la precocidad del diagnóstico viral y su confirmación. En la última década se han desarrollado una serie de técnicas para el diagnóstico viral basadas en la detección de ácidos nucleicos. De ellas la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más utilizada.
En el momento actual, la tendencia en el diagnóstico virológico consiste en emplear nuevas y más sensibles tecnologías de detección de antígenos y de investigación de ácidos nucleicos con el propósito de lograr un diagnóstico viral más rápido. El desarrollo de quimioterapia antiviral efectiva es responsable de esta tendencia que hace de la identificación rápida, sensible y específica de los virus, una necesidad.
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL Métodos para detectar virus.
1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple. • Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus. El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares. Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga).
1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células. 1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
2 Cultivo de los tejidos Cultivo in-vitro de tejidos de Physcomitrella patens en placas de Petri con agar. En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales. Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Fundamento e importancia
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980.
4 Inoculaciones en el embrion del pollo La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Inhibición de Hemaglutinación Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
5 Inhibicion de la aglutinacion La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Tecnica de blotting La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Las virosis son enfermedades de fácil contagio producidas por virus. Estos son agentes patógenos muy pequeños, seres vivos tan diminutos que sólo pueden verse con microscopios electrónicos, que pueden infectar células y provocar infecciones. Se multiplican con extraordinaria rapidez. Los virus según el tejido que ataquen, se clasifican en: • Dermatrópicos, si afectan la piel. • Pneumotrópicos, si afectan los pulmones. • Neurotrópicos, si afectan el sistema nervioso. • Viscerotrópicos, si afectan las vísceras y órganos internos.
Los virus tienen diferentes maneras de transmitirse, algunos lo hacen por el aire, como los de la gripe, paperas, viruela, varicela. El virus de la rabia se trasmite por la saliva del animal infectado. Otros se transmiten por la picadura de mosquitos, como los que producen la fiebre amarilla y el dengue hemorrágico. Otros lo hacen por medio del agua o de alimentos contaminados.
Slide#2 Muchos virus inhiben la síntesis de ARN, ADN o proteica del huésped. Los mecanismos a trav’es de los cuales logran esta inhibición son muy diversos. Efecto citopático (CPE) La presencia del virus con frecuencia implica cambios morfológicos en la célula huésped. Cualquier cambio detectable en la célula huésped provocado por infección se conoce como efecto citopático. Los efectos citopáticos pueden consistir en redondeamiento, desorientación, edematización o encogimiento, muerte, despegamiento de la superficie, etc. Muchos virus inducen apoptosis (muerte celular programada) en las células infectadas. Esto puede ser parte importante de los mecanismos de defensa antivirales de la célula huésped – la muerte celular antes de completarse en ciclo viral replicativo puede limitar la progenie y la difusión de la infección. (Algunos virus endentecen o previenen la apoptosis – dando a sí mismos más oportunidad de replicar más viriones). Algunos virus afectan la regulación de la expresión de los genes de la célula huésped, lo que puede tener consecuencias importantes tanto en la habilidad del virus de crecer, como en la célula huésped per se. Los efectos citopáticos producidos por diferentes virus dependen del virus mismo y de la célula en la que se incorporan. Esto puede ser de utilidad en los laboratorios clínicos de virología par ayudar en la identificación de virus aislados.
Slide#3 La reacción en cadena de la polimerasa, ya más conocida como PCR, es una técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN. Uno de los aportes fundamentales de esta metodología a la investigación básica en biología molecular consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante las cuales se realiza una tarea que antes requería largas y tediosas ¡ornadas. El producto que se obtiene al finalizar la reacción -una gran cantidad de un fragmento génico con alto grado de pureza- favorece la tarea de los investigadores empeñados en ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y función de los genes. Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificación de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el análisis de muestras del niño y de su abuela materna. Entre las aplicaciones médicas de la PCR cabe destacar su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico.
Slide#4 y 5 Los mas utilizados son los embriones de pollo.los huevos fecundados se incuban hasta el momento de su inoculación que suele oscilar entre 6 y 14 días. Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrión (cavidad amniótica, saco vitelino, etc.) La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Slide#6 y 7 ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante unanticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba. La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnóstico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
Diagnostico de Laboratorio Slide 1: Diagnostico de Laboratorio 2012-0593 El diagnóstico virológico comprende la detección e identificación del agente etiológico de una infección viral, clínica o inaparente, y /o de la respuesta inmune específica del huésped. La primera etapa la constituye el diagnóstico viral clínico, que generalmente tiene un carácter de orientación. Se basa principalmente en el cuadro clínico y considera los antecedentes personales y familiares, además de la situación epidemiológica; a menudo se recurre además al laboratorio clínico general. En muchas circunstancias este diagnóstico clínico puede ser suficiente, como en sarampión, hepatitis, varicela, etc. Sin embargo, cada día se observa con mayor frecuencia la asociación de virus con diversos cuadros clínicos, incluso muy severos, en los que el estudio específico de laboratorio virológico se hace indispensable como medio diagnóstico, de control evolutivo, con fines epidemiológicos, etc. Hoy día, el avance de las técnicas diagnósticas ha demostrado que hasta los cuadros más típicamente asignados a una etiología pueden ser causados por otros agentes: las enfermedades son realmente síndromes. Las aplicaciones del diagnóstico virológico son variadas y dependen de los medios disponibles y de las circunstancias que ameriten un diagnóstico etiológico específico. En salud pública se utiliza habitualmente en programas de vigilancia epidemiológica (ej: poliomielitis, influenza, hantavirus, VIH, etc.) y en el control de vacunas mediante censos serológicos, como polio, parotiditis y sarampión. En medicina curativa la necesidad del diagnóstico virológico alcanza a todas las disciplinas: pediatría, obstetricia, medicina, cirugía, dermatología, etc. El aumento de la población de inmunocomprometidos ha creado nuevos problemas por la aparición de cuadros clínicos atípicos y la emergencia de nuevas cepas microbianas. El gran desarrollo de las técnicas de diagnóstico virológico ha permitido ofrecer actualmente una ayuda directa al médico clínico y ha facilitado la investigación en salud, posibilitado su aplicación en muchos campos. Actualmente el médico clínico puede tratar con nuevos antivirales y controlar el curso de muchas infecciones virales, como SIDA, hepatitis B o C, etc. En el presente existe comercialmente una gran variedad de técnicas que pueden implementarse en laboratorios clínicos, por lo que se requiere conocer sus características para seleccionar las de mayor aplicabilidad. El diagnóstico definitivo requiere un análisis de correlación entre los antecedentes clínicos personales, familiares, epidemiológicos y los resultados del laboratorio virológico, considerando la oportunidad y calidad de la muestra, las propiedades de las técnicas utilizadas y la experiencia acumulada al respecto. La conclusión final depende entonces de un trabajo profesional multidisciplinario, más que de una cifra aportada por una moderna máquina automatizada.
Slide 2: Cultivo de tejidos, Efecto Citopatico, Cuerpos de Inclusion 2012-0593 Cultivo in-vitro de tejidos de Physcomitrella patens en placas de Petri con agar. En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales. Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal. Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones. Cambios morfológicos Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales. Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral. Sincitios: Los sincitios son grupos de células fusionadas apreciables como una masa celular multinucleada. La inducción de sincitios se ha observado en la infección por VIH, en concreto por variantes virales muy patogénicas que surgen en etapas tardías de la enfermedad, por lo que tienen valor pronóstico. Igualmente, es una característica frecuente en el virus sincitial respiratorio (que lleva su nombre precisamente por este fenómeno). Su observación generalmente se ha realizado en células en cultivo, pero dicho fenómeno permite in vivo la infección de nuevos linfocitos T CD4+ sin la parte extracelular del ciclo, en la que son más vulnerables a la respuesta humoral.
Slide 3: Reaccion de cadena polimerasa (PCR) 2012-0593 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular que permite la rápida replicación del ADN. Con la PCR, cantidades mínimas de material genético pueden ser amplificadas millones de veces en pocas horas permitiendo la detección rápida y fiable de los marcadores genéticos de enfermedades infecciosas, cáncer y desórdenes genéticos. El uso de la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa ha aumentado mucho la capacidad de los científicos para estudiar el material genético. Desde su invención por científicos de Cetus Corporation en 1983, la PCR ha cambiado la forma en la que se lleva a cabo la investigación y diagnóstico médico. La capacidad de producir rápidamente grandes cantidades de material genético ha permitido avances científicos significativos, incluyendo huella dactilar del ADN y la secuenciación el genoma humano. Además, la tecnología PCR ha influido mucho en los campos del diagnostico de la enfermedad y manejo del paciente, particularmente en las áreas de SIDA y hepatitis C. La PCR está diseñada según el principio natural de replicación del ADN. Es un proceso de tres pasos, designado como un ciclo, que se repite un número específico de veces. Un ciclo de PCR consiste en los siguientes pasos: 1. Desnaturalización 2. Alineación 3. Extensión Este proceso tiene lugar en un termociclador, un instrumento que automáticamente controla y alterna las temperaturas durante períodos programados de tiempo para el número apropiado de ciclos de PCR (generalmente entre 30 y 40 ciclos). Paso 1º PCR: Desnaturalización por calor. El calor (generalmente > 90°C) separa la doble hebra de ADN en dos filamentos, esto se conoce como “desnaturalización". Puesto que los enlaces del hidrógeno que unen las bases de uno a otro son débiles, se rompen a altas temperaturas, mientras que los enlaces entre fosfatos y desoxirribosa, que son enlaces covalentes más fuertes, permanecen intactos.
Slide 3: Reaccion de cadena polimerasa (PCR) 2012-0593
Ciclo PCR - Paso 1º: Desnaturalización por calor Ciclo PCR - Paso 1º: Desnaturalización por calor. Paso 2º PCR: Alineación – unión de la sonda a la secuencia diana. El objetivo no es replicar la hebra entera de ADN sino replicar la secuencia diana de aproximadamente 100-600 pares de bases que es única en el organismo.Los iniciadores marcan el final de la secuencia diana: éstos son sintéticos y cortos, creados a partir de una hebra única de ADN y que normalmente constan de 20-30 bases, con una marca de biotina 5’ al final para ayudar a la detección. Two primers are included in the PCR, one for each of the complementary single DNA strands that was produced during denaturation. The beginning of the DNA target sequence of interest is marked by the primers that anneal (bind) to the complementary sequence. Temperatura de Alineación: generalmente ocurre entre 40°C y 65°C, dependiendo de la longitud y la secuencia de bases de los iniciadores. Permite que éstos se unan a la secuencia diana con alta especificidad. Ciclo PCR - Paso 2º: Un par de iniciadores biotinilados se unen al final de la secuencia diana Ciclo PCR - Paso 2º: Un par de iniciadores biotinilados se unen al final de la secuencia diana.Paso 3º PCR: Extensión Una vez que los iniciadores se han unido a las secuencias complementarias de ADN, la temperatura se eleva aproximadamente a 72°C y la enzima Taq polimerasa replica los filamentos de ADN. La Taq ADN polimerasa es una ADN polimerasa recombinante termoestable del organismo Thermus aquaticus, que a diferencia de otras polimerasas se mantiene activa a elevada temperatura. Comienza el proceso de síntesis en la región marcada por los iniciadores y sintetiza una nueva hélice de ADN de doble hebra, ambas idénticas al original, para facilitar la unión de los nucleótidos complementarios que quedan libres en la solución (dNTPs). La extensión comienza siempre en el extremo 3' del iniciador creando una doble tira a partir de cada una de las hebras individuales. La Taq ADN polimerasa sintetiza exclusivamente en la dirección 5’ a 3’. No obstante los nucleótidos libres en la solución sólo se añaden al extremo 3`del iniciador, construyendo la tira complementaria de la secuencia de ADN. Ciclo PCR - Paso 3º: La Taq ADN polimerasa cataliza la extensión de los iniciadores de modo complementario. Se incorporan los nucleótidos Ciclo PCR - Paso 3º: La Taq ADN polimerasa cataliza la extensión de los iniciadores de modo complementario. Se incorporan los nucleótidos Final del primer ciclo de PCR Al final del primer ciclo de PCR, nos encontramos dos nuevas tiras de ADN idénticas al original. Punto final: La ADN polimerasa no reconoce el final de la secuencia. Las nuevas hebras formadas tienen un principio, definido precisamente por el extremo 5’ del iniciador, aunque el extremo 3' no queda definido. Mientras que el número de ciclos aumenta, una hebra con una longitud más definida sirve como plantilla para la nueva secuencia sintetizada. La hebra de ADN sintetizada a partir esta plantilla tiene una longitud definida que está limitada por el extremo 5’ de cada uno de los dos iniciadores. Estas hebras de ADN se denominan AMPLICONES. Después de algunos ciclos, las hebras de DNA que corresponden a la secuencia diana, están presentes en un número mucho mayor que las secuencias de longitud variable. En otras palabras la secuencia flanqueada o definida por los dos iniciadores es la sección que se amplifica.
Slide 5: Inhibicion de la Hemaglutinacion 2012-0593 Se denomina aglutinación a la interacción in vitro de un antígeno particulado ( por lo general células) con su anticuerpo específico. Hemoaglutinación es la propiedad que tienen ciertos virus para unir y aglutinar eritrocitos de mamíferos y aves, debido a las proteínas que poseen en su capa externa Esta hemoaglutinación inducida por virus puede usarse para facilitar la identificación de un virus desconocido.La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos. Slide 6:ELISA 2012-0593 Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen: La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción. La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente. No se necesita ninguna preparación especial. Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil. Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes. Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen. Significado de los resultados anormales Los valores anormales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. En algunas personas, un resultado positivo puede ser normal.
Slide 7: Tecnicas analíticas de Blotting 2012-0593 La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL
Métodos para detectar virus.
Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.
• Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga).
Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células.
Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
Inmunofluorescencia directa, utilizando células del paciente, como leucocitos, orina o mucosa oral o genital, para buscar virus.
Detección de ácidos nucleicos virales por reacción de polimerasa en cadena, las cuales permiten amplificar una porción pequeña de ácido nucleico en un período de tiempo corto.
En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.
Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética,mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
Iniciación
El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas, con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza, dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán a partir del explanto original dependen de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como tallos, raíces, bulbos u otros órganos. Estos tejidos cultivados in vitro se hallan dentro de un microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico, protegidos del medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo, que pueda entrar al mismo, crecerá de forma oportunista a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos.
Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es «cultivar los tejidos», deben proveerse además ciertos requerimientos externos: los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o pueden colocarse en un medio líquido.
Los tejidos también necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y una mezcla de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares.
Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo, en general, es necesario el suministro de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio de cultivo, más que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios altos niveles de luz.
Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Fundamento e importancia
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980.
Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo.
Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos.
Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).
Termociclador: aparato en el que se efectúa la PCR convencional. Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción.
Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción.
Los termocicladores más antiguos carecían de este sistema y solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos.
Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida.
Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos. Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares.
El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida.
Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer: -En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo. -En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña. -En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.
En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnostico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
Inmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%. Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas. Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%.
Tiempo de procesamiento de los examenes: La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:
Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar.
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda.
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Síntomas Los síntomas son muy variables y dependen del virus y del órgano afectado. Muchos virus, como muchas bacterias, producen fiebre y síntomas respiratorios (tos, estornudos) o intestinales (náuseas, vómito, diarrea). Las virosis, aun cuando no sean de peligro, a menudo provocan fiebre elevada en los niños de corta edad.
Diagnóstico Algunas infecciones virales, como la gripe, el resfriado común, la varicela son fáciles de identificar por sus síntomas, sin que se necesiten análisis de laboratorio. Para otras, como la hepatitis viral, el sida y la mononucleosis infecciosa, se suele analizar una muestra de sangre en busca de anticuerpos específicos contra el virus. La presencia de estos anticuerpos confirma el diagnóstico. En ciertos casos, los virus pueden cultivarse en tejidos celulares o bien el virus se identifica por su ácido nucleico, valiéndose de una técnica que recibe el nombre de reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Las pruebas como el RCP o el cultivo celular se emplean cuando las de anticuerpos no tienen la precisión suficiente o cuando es necesario cuantificar con mayor exactitud el virus invasor.
Las aplicaciones del diagnóstico virológico son variadas y dependen de los medios disponibles y de las circunstancias que ameriten un diagnóstico etiológico específico. En salud pública se utiliza habitualmente en programas de vigilancia epidemiológica (ej: poliomielitis, influenza, hantavirus, VIH, etc.) y en el control de vacunas mediante censos serológicos, como polio, parotiditis y sarampión. En medicina curativa la necesidad del diagnóstico virológico alcanza a todas las disciplinas: pediatría, obstetricia, medicina, cirugía, dermatología, etc. * Efecto citopatico Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones. Cambios morfológicos Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral.
*Cuerpos de inclusión
Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus). Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
Cultivo in-vitro de tejidos de Physcomitrella patens en placas de Petri con agar. En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales. Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
4 Inoculaciones en el embrion del pollo La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación. Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
El mayor inconveniente de la prueba es el hecho de que otros componentes del suero de los pacientes, además de los anticuerpos, pueden a su vez inhibir la hemaglutinación, se denominan inhibidores inespecíficos los cuales deben ser eliminados antes de realizar la prueba.
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica "in vitro" que imita la habilidad natural de la célula de duplicar el ADN. Se trata de una técnica usada para crear un gran número de copias de un segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalización, apareamiento con cebadores y extensión por una ADN polimerasa termoresistente.
2. Proceso: La mezcla de reacción se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de desnaturalización, una de hibridación o alineación y una de elongación. a) Durante la desnaturalización, que se realiza por calentamiento de la mezcla a 95ºC, se separan las dos cadenas del ADN molde. b) Durante la hibridación, la temperatura de incubación se reduce para permitir el apareamiento de las bases de ambos cebadores en el sitio donde encuentran una secuencia complementaria. c) Durante la fase de elongación, la mezcla se calienta a 72ºC y la enzima Taq ADN polimerasa se usa para replicar las hebras de DNA. La Taq polimerasa comienza el proceso de extensión de la cadena complementaria a partir del extremo 3’ de los cebadores. Al finalizar cada ciclo, la cantidad de ADN molde disponible para el ciclo siguiente aumenta al doble. Entre muchas de las aplicaciones que la PCR pone a disposición se encuentran la detección precoz o prenatal de enfermedades genéticas, la detección de infecciones virales latentes o la producción de grandes cantidades de fragmentos de ADN humano a una velocidad muy superior a la posible mediante otros métodos. Esta técnica también se aplica para estudios de identidad y filiación.
* Inoculaciones en el embrión de pollo
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida.
Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos. Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay)
La técnica ELISA (Análisis Inmuno Absorbente Ligado a Enzimas) Se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, puede ser medido espectrofotométricamente.
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes :
Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc.. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.
Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.
Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría. En el esquema se muestra la reacción asociada a un ELISA directo.
TIPOS DE ELISA
ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). ELISA indirecto. ELISA 'sandwich'.
Las virosis son enfermedades de fácil contagio producidas por virus. Estos son agentes patógenos muy pequeños, seres vivos tan diminutos que sólo pueden verse con microscopios electrónicos, que pueden infectar células y provocar infecciones. Se multiplican con extraordinaria rapidez. Los virus según el tejido que ataquen, se clasifican en: • Dermatrópicos, si afectan la piel. • Pneumotrópicos, si afectan los pulmones. • Neurotrópicos, si afectan el sistema nervioso. • Viscerotrópicos, si afectan las vísceras y órganos internos.
Los virus tienen diferentes maneras de transmitirse, algunos lo hacen por el aire, como los de la gripe, paperas, viruela, varicela. El virus de la rabia se trasmite por la saliva del animal infectado. Otros se transmiten por la picadura de mosquitos, como los que producen la fiebre amarilla y el dengue hemorrágico. Otros lo hacen por medio del agua o de alimentos contaminados.
Diapositiva 2 Muchos virus inhiben la síntesis de ARN, ADN o proteica del huésped. Los mecanismos a trav’es de los cuales logran esta inhibición son muy diversos. Efecto citopático (CPE) La presencia del virus con frecuencia implica cambios morfológicos en la célula huésped. Cualquier cambio detectable en la célula huésped provocado por infección se conoce como efecto citopático. Los efectos citopáticos pueden consistir en redondeamiento, desorientación, edematización o encogimiento, muerte, despegamiento de la superficie, etc. Muchos virus inducen apoptosis (muerte celular programada) en las células infectadas. Esto puede ser parte importante de los mecanismos de defensa antivirales de la célula huésped – la muerte celular antes de completarse en ciclo viral replicativo puede limitar la progenie y la difusión de la infección. (Algunos virus endentecen o previenen la apoptosis – dando a sí mismos más oportunidad de replicar más viriones). Algunos virus afectan la regulación de la expresión de los genes de la célula huésped, lo que puede tener consecuencias importantes tanto en la habilidad del virus de crecer, como en la célula huésped per se. Los efectos citopáticos producidos por diferentes virus dependen del virus mismo y de la célula en la que se incorporan. Esto puede ser de utilidad en los laboratorios clínicos de virología par ayudar en la identificación de virus aislados.
2011-0029 José Luis González Salas Diapositiva 3 La reacción en cadena de la polimerasa, ya más conocida como PCR, es una técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN. Uno de los aportes fundamentales de esta metodología a la investigación básica en biología molecular consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante las cuales se realiza una tarea que antes requería largas y tediosas ¡ornadas. El producto que se obtiene al finalizar la reacción -una gran cantidad de un fragmento génico con alto grado de pureza- favorece la tarea de los investigadores empeñados en ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y función de los genes. Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificación de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el análisis de muestras del niño y de su abuela materna. Entre las aplicaciones médicas de la PCR cabe destacar su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico.
Diapositiva 4 y 5 Los mas utilizados son los embriones de pollo.los huevos fecundados se incuban hasta el momento de su inoculación que suele oscilar entre 6 y 14 días. Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrión (cavidad amniótica, saco vitelino, etc.) La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
2011-0029 José Luis González Salas Diapositiva 6 y 7
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante unanticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba. La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnóstico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
89693 - Fabiano Lima das Gracas Virologia – Grupo Lunes 10-12pm
1-Diagnostico de las Virosis:
En la actualidad existen métodos para detectar los virus mediante microscopía óptica. Naturalmente no permiten la visualización individualizada de los viriones, sino la presencia de grandes acúmulos de material vírico intracelular, que pueden teñirse y constituyen los denominados cuerpos de inclusión La utilización de anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes permite detectar en las células infectadas los antígenos víricos específicos formando acúmulos o distribuidos de forma difusa. Este tipo de observaciones puede hacerse tanto sobre tejidos humanos infectados naturalmente como sobre cultivos celulares inoculados en el laboratorio.
Aislamiento y propagación de los virus Los virus, a diferencia de los que sucede con la mayoría de las bacterias, hongos y protozoos, sólo pueden multiplicarse en el interior de células vivas, no pudiendo hacerlo en un medio nutritivo carente de células. Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el laboratorio son: 1. animales de experimentación 2. embriones animales 3. cultivos celulares artificiales.
89693 - Fabiano Lima das Gracas Virologia – Grupo Lunes 10-12pm
2-Cultivo de tejidos, Efecto Citopaticos y Cuerpos de Inclusion:
Cultivos celulares: Se denomina cultivo celular a la multiplicación y mantenimiento de células in vitro Las células se obtienen de un fragmento de un órgano como el riñón, el pulmón u otros, por trituración y posterior disgregación con tripsina, lo que permite obtener células aisladas que se introducen en frascos con medios de cultivo adecuados. Los cultivos celulares, por tanto, están formados por células disgregadas que han perdido su organización tisular, a diferencia de los cultivos de tejidos u órganos en que se conserva esa estructura. Las células en los frascos pueden estar en suspensión, es decir, libres en el medio de cultivo líquido o adosadas a la pared del frasco, como unas baldosas, y bañadas por el medio. En el primer caso se trata de células en suspensión y en el segundo en monocapa. Se denomina cultivo celular primario en suspensión o monocapa, al obtenido a partir de las células normales de un órgano de un animal adulto. Estas células se mantienen vivas algún tiempo en el cultivo, pero no pueden propagarse in vitro. Se denominan líneas celulares o cultivos celulares de línea a los que tras la obtención de las células de un órgano o tejido pueden propagarse posteriormente in vitro. Existen varios tipos de células de línea, como las de tejidos embrionarios, que sólo permiten alrededor de 50 subcultivos y mueren y las células de tejidos neoplásicos, que se propagan indefinidamente y se denominan líneas celulares continuas, confirmándose este hecho cuando se han propagado durante más de 70 pases. Los virus o las muestras clínicas se inoculan a estos cultivos celulares. Según el virus que se pretende aislar se utiliza uno u otro sistema celular.
Acción citopática: Se denomina acción citopática la lesión que causan algunos virus a las células en que se replican. Las lesiones celulares pueden ser intensas y precoces, produciendo en 24 o 48horas la muerte celular, acompañada de lisis fácilmente observable al inspeccionar los cultivos celulares con un microscopio. En otras ocasiones las alteraciones morfológicas que se producen en las células son mínimas o tardías y muy difíciles de detectar. En las células infectadas por determinados virus pueden observarse cuerpos de inclusión, acompañando a las alteraciones celulares más o menos importantes. Los cuerpos de inclusión pueden visualizarse, después de la tinción de las células con hematoxilina eritrosina, como masas con morfología más o menos característica y localización nuclear o citoplasmática típica, según los virus que los originan. Están constituidos por acúmulos del material vírico sintetizado depositados en zonas celulares alteradas; en ocasiones predomina o es exclusivo el depósito de material vírico y en otras lo prominente o exclusivo es la lesión celular. El aspecto particular y característico de cada tipo de inclusión suele orientar sobre el grupo de virus que la produce. La formación de cuerpos de inclusión ocurre tanto in vivo, en las infecciones naturales, como en los cultivos celulares infectados. Ya se ha señalado que, aparte de la acción citopática directa, la lesión de las células infectadas por un virus puede deberse a la respuesta inmune dirigida contra antígenos codificados por el virus y expresados en la superficie celular.
89693 - Fabiano Lima das Gracas Virologia – Grupo Lunes 10-12pm
3-Reaccion en la Cadena de Polimerasa: (PCR)
Detección de ácidos nucleicos
El método mas utilizado para detección de acidos nucleicos es la Reacción en Cadena de la Polimerasa, PCR, que es una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, que utiliza una ADN polimerasa y oligonucleótidos cebadores, primers, para producir luego de varios ciclos, millones de moléculas del fragmento seleccionado a partir de una sola copia. Los productos de PCR pueden ser detectados por tinción con bromuro de etidio y electroforesis en geles de agarosa. Esta técnica permite detectar mínimas cantidades de ácidos nucleicos en muestras clínicas y por lo tanto ha significado un gran avance con respecto a los métodos convencionales.
89693 - Fabiano Lima das Gracas Virologia – Grupo Lunes 10-12pm
4-Inoculaciones en el Embrion de Pollo:
Embriones animales: Los más utilizados son los embriones de pollo (huevos de gallina fecundados). Los huevos fecundados se incuban hasta el momento de su inoculación que suele oscilar entre 6 y 14 días. Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrión, requieren experiencia para su realización. La inoculación en la cavidad amniótica es las más utilizada para el aislamiento de virus a partir de muestras clínicas. Este sistema es el más adecuado para el aislamiento de los virus de la gripe.
89693 - Fabiano Lima das Gracas Virologia – Grupo Lunes 10-12pm
5-Inhibicion de la Hemaglutinacion:
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
89693 - Fabiano Lima das Gracas Virologia – Grupo Lunes 10-12pm
6-ELISA:
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba. La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune.
89693 - Fabiano Lima das Gracas Virologia – Grupo Lunes 10-12pm
7-Tecnicas Analiticas de Bloting:
Dot Blot es una técnica de biología molecular para detectar biomoléculas. Representa una simplificación de los métodos Northern blot, Southern blot o Western blot. En un dot blot las biomoléculas para ser detectados no son separadas por cromatografía. En cambio, una gota que contiene la molécula para ser detectada se aplica directamente sobre una membrana. Esto es seguido por la detección por sondas de nucleótidos (northern blot y southern blot) o anticuerpos (para un western blot). La técnica ofrece importantes ahorros en tiempo. Sin embargo, no ofrece información sobre el tamaño de la biomolécula blanco. Además, si dos moléculas de diferentes tamaños son detectadas, se seguirá viendo como un solo punto. Por lo tanto el dot blot sólo puede confirmar la presencia o ausencia de una biomolécula o biomoléculas que pueden ser detectados por las sondas de ADN o el anticuerpo. La siguiente imagen ilustra el resultado obtenido de realizar un protocolo dot blot en el que se fijaron muestras de ADN a la membrana, y posteriormente se hibridaron con sondas marcadas radiactivamente específicas de ciertas regiones del ADN de estudio. Solamente las muestras portadoras de la región de interés se revelaron (puntos oscuros). Cuanto mayor es la cantidad del ADN de interés, mayor es la intensidad del color negro. Una muestra radiactiva puede ser hibridada para permitir al investigador
88977 tema: Diagnostico de la virosis Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, según persigan demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos específicos por parte del huésped en el curso de la infección.
Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico clínico se basan en pruebas serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas. Sin embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten precozmente la infección viral (tratamientos específicos, medidas profilácticas, etc.).
En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia de antígenos virales previamente al desarrollo de la seroconversión, siendo esta prueba la única evidencia de la exposición al virus cuando no existe aumento de los niveles de anticuerpos circulantes (pacientes inmunodeprimidos).
Igualmente la detección del genoma viral puede favorecer la precocidad del diagnóstico viral y su confirmación. En la última década se han desarrollado una serie de técnicas para el diagnóstico viral basadas en la detección de ácidos nucleicos. De ellas la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más utilizada.
88977 cultivo de tejido- efecto citopatico - cuerpos de inclusión
Cultivo de tejidos. Puede definirse como el conjunto de técnicas que permiten el cultivo en condiciones asépticas de órganos, tejidos, células y protoplastos. Constituye dentro de las biotecnologías, la que mayor aporte práctico ha brindado. Sus aplicaciones van desde estudios teóricos sobre fisiología y bioquímica vegetal, hasta la obtención de plantas libres de patógenos, conservación de germoplasma, produccción de metabolitos secuandarios, propagación masiva de plantas, mejoramiento genético, inducción de mutaciones, selección in vitro y desarrollo de protocolos de regeneración de plantas para su utilización en ingeniería genética.
Efecto citopático (CPE) La presencia del virus con frecuencia implica cambios morfológicos en la célula huésped. Cualquier cambio detectable en la célula huésped provocado por infección se conoce como efecto citopático. Los efectos citopáticos pueden consistir en redondeamiento, desorientación, edematización o encogimiento, muerte, despegamiento de la superficie, etc.
Muchos virus inducen apoptosis (muerte celular programada) en las células infectadas. Esto puede ser parte importante de los mecanismos de defensa antivirales de la célula huésped – la muerte celular antes de completarse en ciclo viral replicativo puede limitar la progenie y la difusión de la infección. (Algunos virus endentecen o previenen la apoptosis – dando a sí mismos más oportunidad de replicar más viriones).
Algunos virus afectan la regulación de la expresión de los genes de la célula huésped, lo que puede tener consecuencias importantes tanto en la habilidad del virus de crecer, como en la célula huésped per se.
Los efectos citopáticos producidos por diferentes virus dependen del virus mismo y de la célula en la que se incorporan. Esto puede ser de utilidad en los laboratorios clínicos de virología par ayudar en la identificación de virus aislados.
cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus). Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
88977 Reacción en cadena de la polimerasa Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
88977 Inoculaciones de pollo los embriones de pollolos huevos fecundados se incuban hasta el momento de su inoculación que suele oscilar entre 6 y 14 días. Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrión (cavidad amniótica, saco vitelinol etc.).
Inoculación por saco alantoideo Inoculación en saco amniótico Con colorante: líquido amniótico, cámara de aire Inoculación en saco amniótico Inoculación en saco vitelino Inoculación de membrana corioalantoidea (MCA)Con colorante: membrana corioalantoidea permite cuantificar aquellos grupos virales que producen lesiones localizadasEmbrion de 10-12 días, inoculo de 0.1-0.5ml
88977 INHIBICION DE LA HEMAGLUTINACION La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
88977 ELISA Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre. La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente. Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
88977 La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Christopher Robles 2011-0692 Diagnostico de Laboratorio
Slide 1-2, Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped. DIAGNOSTICO VIRAL 1. Métodos para detectar virus. 1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico. • Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple. • Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus. El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares. Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica. Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga). 1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células. 1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
Slide 2 -Pruebas diagnósticas Inmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%. Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas. Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%. Tiempo de procesamiento de los examenes: La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
Slide 3, Efecto citopático Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones. Cambios morfológicos Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales. Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral. Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral. Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus). Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
Slide 4, La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos. Inhibición de Hemaglutinación Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación. Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
Slide 5, ELISA es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre. Forma en que se realiza el examen La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción. La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente. Preparación para el examen No se necesita ninguna preparación especial. Lo que se siente durante el examen Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil. Razones por las que se realiza el examen Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes. Valores normales Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen. • ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
Slide 6, La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
El primer paso para hacer el diagnóstico de la virosis consiste en la observación e identificación de síntomas y signos productos de infecciones por virus. Ante la sospecha de una infección viral, se procede a tomarle muestras al paciente para análisis directo que demuestre la presencia del virus en la muestra o para análisis indirecto mediante la determinación de anticuerpos específicos en el suero. Por el método indirecto se diagnostican infecciones agudas por la presencia de IgM, seroconversión y serorefuerzo e infecciones crónicas por un alza en la IgG y avidez. En cambio, en el análisis directo se detectan componentes estructurales virales o se visualizan partículas virales en las muestras obtenidas de: orina, heces, tracto respiratorio, piel y sangre. Especificamente, el análisis directo se lleva a cabo por microscopia electrónica o se realiza un Western Blot en caso de que se sospeche que el paciente tenga HIV. De igual forma, también se amplifica el DNA mediante PCR.
# 2012-1270 Cultivo de tejidos, efecto citopático y cuerpos de inclusión El cultivo de tejidos también denominado cultivo celular, conjunto de técnicas para mantener en vida células aisladas o fragmentos de tejido, en un ambiente artificial que permita sus diversas actividades funcionales. Las distintas técnicas usadas tienen algunos elementos básicos en común: la obtención de una muestra de células o de fragmento de tejidos debe ser efectuada en condiciones asépticas para evitar la contaminación del cultivo por parte de bacterias u hongos; hay que respetar las condiciones de temperatura, grado de acidez (pH), presión osmótica y concentración de algún gas, óptimo para el modelo biológico utilizado; también se debe cuidar especialmente la nutrición del cultivo mediante líquidos o medios de cultivo (naturales o sintéticos) renovados a intervalos oportunos. Los medios de cultivo de tejidos más difundidos son soluciones tamponadas de sales inorgánicas, aminoácidos, carbohidratos, bases nitrogenadas y vitaminas, compuestas adecuadamente en base a las características metabólicas de las células del cultivo.
En cambio, el efecto citopático hace referencia a cualquier cambio detectable en la célula huésped provocado por infección. Los efectos citopáticos pueden consistir en redondeamiento, desorientación, edematización o encogimiento, muerte, despegamiento de la superficie, etc.
Muchos virus inducen apoptosis en las células infectadas. Esto puede ser parte importante de los mecanismos de defensa antivirales de la célula huésped – la muerte celular antes de completarse en ciclo viral replicativo puede limitar la progenie y la difusión de la infección.
Algunos virus afectan la regulación de la expresión de los genes de la célula huésped, lo que puede tener consecuencias importantes tanto en la habilidad del virus de crecer, como en la célula huésped per se.
Los efectos citopáticos producidos por diferentes virus dependen del virus mismo y de la célula en la que se incorporan. Esto puede ser de utilidad en los laboratorios clínicos de virología para ayudar en la identificación de virus aislados.
Por último, muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (VIH) y en otros como pequeñas vesículas.
Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (reovirus).
# 2012-1270 Reaccion en cadena de la polimerasa Esta técnica permite multiplicar pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta más de dos mil nucleótidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas.
El método se basa, en su forma más simple en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y cuarenta veces.. La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separación de las dos cadenas que constituyen el ADN, hecho que se conoce como "desnaturalización". En el segundo paso, la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucleótidos (oligonucleóridos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Se trata de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera tal que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar. Obviamente, para que se pueda producir el apareamiento, cada uno de estos oligonucleótidos, a los que se denomina "iniciadores" o primers, debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del ADN molde. En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa desoxidonucleósidos trifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de reacción. La temperatura a la que se realiza el tercer paso está condicionada por aquélla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, apareamiento, extensión) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers. Una vez finalizada la reacción se habrá logrado fabricar, en pocas horas, gran cantidad de un fragmento génico con un alto grado de pureza.
# 2012-1270 Inoculaciones en el embrión de pollo Se han utilizado huevos fecundados para cultivar virus, durante más de 15 años. Un virus en particular, solo puede reproducirse en determinadas partes del huevo. Por consiguiente, se deben inocular, en la región apropiada. A) Membrana corioalantoidea: para el aislamiento y cultivo de Poxvirus, algunos Mixovirus y ciertos Rhabdovirus, que provocan pustulas visibles. Los embriones son de 10 a 12 días. El inóculo es de 0.1 a 0.5 mL. B) Embrion: Para aislamiento de virus de la rabia o herpesvirus neurotrópicos, que provocan encefalitis. Los embriones deben ser de 8 a 14 días y el inóculo es de 0.01 a 0.02 mL. C) Cavidad alantoidea: Se desarrollan bien el virus de la Parotiditis, los de las Encefalomielitis Equina del Oeste, del Este y Venezolana, algunos Paramixovirus y el de la peste aviar. Los embriones deben tener 9 a 12 días y el inóculo es de 0.1 a 0.2 mL. D) Cavidad amniótica: Para varios tipos de virus. La inoculación en esta cavidad, se realiza para aislar en forma primaria, al virus de la Influenza. Se emplean embriones de 7 a 15 dias y el inoculo es de 0.1 a 0.2mL. E) Saco vitelino: Virus que causan ETS, ERA y rickettsias. Embriones de 5 a 8 dias e inoculo de 0.2 a 1 mL.
La hemoaglutinación es la habilidad que tienen ciertos virus para unir y aglutinar eritrocitos de mamíferos y aves debido a las proteínas que poseen en su capa externa. Esta hemoaglutinación puede usarse para facilitar la identificación de un virus desconocido.
La actividad enzimàtica de las proteínas virales (hemaglutininas) produce hemaglutinaciòn en la cual los eritrocitos se unen por medio de puentes. Se ha demostrado que el glóbulo rojo contiene cerca de 300 sitios en los cuales se puede adsorber un virus. Muchos virus contienen proteínas en su capa externa que los capacitan para aglutinar glóbulos rojos de varias especies. Elusión es la liberación del virus. El virus produce elusión sobre el glóbulo rojo a 37° C debido a la destrucción del ácido neuramínico en sus receptores por la neurominidasa del virión. El virus eluido puede aglutinar un glóbulo rojo fresco, pero éste, una vez eluido ya no puede ser aglutinado por la misma especie de virus, debido a la pérdida de sus receptores.
La inhibición de la hemoaglutinación (IHA) es la unión de anticuerpos a la hemoaglutinina del virus. Las pruebas de IHA constituyen métodos de diagnóstico e investigación sencillos y útiles en la identificación de virus, determinación de la relación antigénica de virus aislados, identificación y cuantificación de anticuerpos contra virus. Características: ● Pruebas altamente específicas y sensibles. ● Se pueden adaptar fácilmente a laboratorios de escasa infraestructura por el bajo costo de los reactivos. ● Son simples y rápidas. Hay dos métodos para realizar la IHA, en uno se realizan diluciones decrecientes de virus y se enfrentan a cantidades constantes de suero (alfa) y diluciones decrecientes de suero que se enfrentan a cantidades constantes de virus (beta). El método beta es el más comunmente utilizado Las pruebas de IHA constituyen métodos de diagnóstico e investigación sencillos y útiles en la: a. Identificación de virus. b. Determinación de la relación antigénica entre virus aislados. c. Identificación y cuantificación de anticuerpos contra virus.
Los inhibidores específicos e inespecíficos actúan inhibiendo competitivamente con los anticuerpos la hemaglutinina del virus. El suero de muchas especies contienen inhibidores inespecíficos o aglutininas inespecíficas que pueden conducir a errores en los resultados, por los que deben ser destruidos antes de realizar una prueba de IHA, para permitir la determinación del nivel de anticuerpos específicos en un suero o para la correcta identificación de un virus aislado.
La técnica de ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) es utilizada para la detección de muy diversas moléculas biológicas, basándose en la especificidad del reconocimiento antígeno-anticuerpo y en la sensibilidad de las pruebas enzimáticas.
La técnica de ELISA es un ensayo inmunoenzimático ampliamente empleado en el área médica para la cuantificación de moléculas especialmente de aquellas que experimentan cambios en diferentes estados como pueden ser infecciones por bacterias, virus, hongos o parásitos o fases activas de enfermedades autoinmunes. Como ejemplo se pueden medir por ELISA hormonas, autoanticuerpos, inmunoglobulinas contra antígenos de patógenos, toxinas, antígenos. Las técnicas de ELISA son también muy usadas en los ensayos de nuevos medicamentos para comprobar sus efectos cuantificando las moléculas de interés en cada caso. Existen numerosas variantes de este tipo de ensayo. Entre ellos se encuentran los métodos directo e indirecto. El método directo permite la detección del antígeno con un anticuerpo específico conjugado con una enzima como sistema de marcaje. En el método indirecto el antígeno reacciona con el anticuerpo específico. El complejo antígeno-anticuerpo es entonces detectado por un segundo anticuerpo que reconoce dominios constantes de anticuerpos. Este anticuerpo, que suele ser específico de especie, es el que está marcado enzimáticamente. Esto permite que un mismo anticuerpo marcado sea capaz de detectar diferentes antígenos. En ambos métodos, la reacción enzimática puede ser detectada espectrofotográficamente con un lector ELISA.
El southern blot es un método para sondear la presencia de una secuencia específica de ADN en una muestra de ADN. Muestras de ADN antes o después de la digestión de la enzima de restricción se separan por electroforesis en gel y luego transferidas a una membrana por Blot a través de la acción capilar. La membrana entonces está expuesta a una sonda de ADN etiquetada que tiene una secuencia base de complemento a la secuencia de ADN de interés. Protocolos más originales utilizan etiquetas radiactivas, ahora existen alternativas sin embargo no radiactivos.
En cambio, el northern blot se utiliza para estudiar los patrones de expresión de un tipo específico de la molécula de ARN como comparación relativa entre un conjunto de diferentes muestras de ARN. Es esencialmente una combinación de desnaturalización electroforesis en gel RNA y una mancha. En este proceso de ARN está separado basado en tamaño y es transferido a una membrana que luego es sondeada con un etiquetado como complemento de una secuencia de interés. Los resultados pueden visualizarse a través de una variedad de formas dependiendo de la etiqueta utilizada; Sin embargo, la mayoría como resultado la revelación de bandas que representa el tamaño del ARN detectado en la muestra. La intensidad de estas bandas está relacionada con la cantidad del objetivo del RNA en las muestras analizadas.
Por otro lado, el western blot son anticuerpos contra la mayoría de las proteínas. Se pueden crear inyectando pequeñas cantidades de la proteína en un animal como un ratón, conejos, ovejas o burro (anticuerpos policlonales) o producido en cultivos celulares (anticuerpos monoclonales). Estos anticuerpos pueden utilizarse para una variedad de técnicas analíticas y preparativos.
En western Blot, las proteínas en primer lugar se separan por tamaño en un gel fino entre dos placas de vidrio (SDS-PAGE). Las proteínas en el gel luego son transferidas a un PVDF, nitrocelulosa, nylon o otro membrana de soporte que puede ser sondeada con soluciones de anticuerpos. Estos se unen a la proteína de interés y pueden visualizarse por una variedad de técnicas, incluyendo productos coloreados, quimioluminiscencia o autorradiografía. A menudo, los anticuerpos están etiquetados con enzimas y se detectan cuando son expuestos a sustratos quimioluminiscentes. Utilizando técnicas occidentales Blot permite no sólo la detección, sino también el análisis cuantitativo. Se detecta la modificación post-translacional de las proteínas.
Wladimir A. Rijo Inirio 89257 D# 1(DIAGNÓSTICO DE LAS VIROSIS)
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL 1. Métodos para detectar virus. 1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico. • Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple. • Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus. El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares. Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica. Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga). 1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células. 1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
Wladimir A. Rijo Inirio 89257 D# 2(Pruebas diagnósticas)
Inmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%. Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas. Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%.
Tiempo de procesamiento de los examenes: La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
Wladimir A. Rijo Inirio 89257 D# 3 (Efecto citopático)
Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales. Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral. Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus). Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos. Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación. Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
Preparación para el examen No se necesita ninguna preparación especial.
Lo que se siente durante el examen Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil.
Razones por las que se realiza el examen Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Valores normales Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen. • ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda.
1.Diagnóstico de virosis El diagnóstico virológico comprende la detección e identificación del agente etiológico de una infección viral, clínica o inaparente, y /o de la respuesta inmune específica del huésped. El paciente es puesto bajo observacion para analizar signos y sintomas de la manifestacion de infecciones virales tipicas. Se toma muestra de sangre del paciente para analizar en sus celulas efectos citopaticos y antigenos virales. El metodo o tecnica de microscopia electronica es utilizado para ver los viruses directamente. Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico clínico se basan en pruebas serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas. Sin embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten precozmente la infección viral (tratamientos específicos, medidas profilácticas, etc.). En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia de antígenos virales previamente al desarrollo de la seroconversión, siendo esta prueba la única evidencia de la exposición al virus cuando no existe aumento de los niveles de anticuerpos circulantes (pacientes inmunodeprimidos). Aplicaciones-En salud pública se utiliza habitualmente en programas de vigilancia epidemiológica (ej: poliomielitis, influenza, hantavirus, VIH, etc.) y en el control de vacunas mediante censos serológicos, como polio, parotiditis y sarampión. En medicina curativa la necesidad del diagnóstico virológico alcanza a todas las disciplinas: pediatría, obstetricia, medicina, cirugía, dermatología, etc. El aumento de la población de inmunocomprometidos ha creado nuevos problemas por la aparición de cuadros clínicos atípicos y la emergencia de nuevas cepas microbianas. El gran desarrollo de las técnicas de diagnóstico virológico ha permitido ofrecer actualmente una ayuda directa al médico clínico y ha facilitado la investigación en salud, posibilitado su aplicación en muchos campos. Actualmente el médico clínico puede tratar con nuevos antivirales y controlar el curso de muchas infecciones virales, como SIDA, hepatitis B o C, etc. En el presente existe comercialmente una gran variedad de técnicas que pueden implementarse en laboratorios clínicos, por lo que se requiere conocer sus características para seleccionar las de mayor aplicabilidad.
2.Cultivo de tejidos, efecto citopatico y cuerpos de inclusion Cultivo de tejidos o cultivo in vitro- surgió como una técnica de reproducción sin ningún tipo de contaminación en condiciones estériles cuando se buscaba mejorar los productos vegetales y animales. Esta técnica consiste en tomar unas pocas células ubicadas en un segmento pequeño de tejido y regenerar en poco tiempo miles o millones de organismos con las mismas características del tejido original. Esta investigación en cultivo de tejidos puede conseguir muchos avances en la investigación sobre los procesos bioquímicos y morfológicos de la diferenciación celular, en el desarrollo de tecnologías para la propagación clonal o en el mejoramiento genético de plantas o animales.
Efecto citopatico- cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones. Hay cambios morfológicos y lisis cellular que es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.
Cuerpos de inclusión -son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus). Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
3.PCR La reacción en cadena de la polimerasa o PCR, es una técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN. Uno de los aportes fundamentales de esta metodología a la investigación básica en biología molecular consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante las cuales se realiza una tarea que antes requería largas y tediosas jornadas. El producto que se obtiene al finalizar la reacción -una gran cantidad de un fragmento génico con alto grado de pureza, favorece la tarea de los investigadores empeñados en ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y función de los genes. Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificación de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el análisis de muestras del niño y de su abuela materna. Entre las aplicaciones médicas de la PCR cabe destacar su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico. Permite detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Ha sido aplicada, por ejemplo, para diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recién nacidos de madres seropositivas, pues la existencia de anticuerpos maternos impide obtener resultados confiables, con los métodos convencionales, durante el primer año de vida. También ha facilitado el diagnóstico de enfermedades tales como las hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis quística, e hizo posible reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológ icas. Su sensibilidad permite detectar poblaciones residuales de células cancerosas en pacientes sometidos a quimioterapia y de este modo se ha podido determinar, con una antelación en extremo valiosa, un nuevo avance de la enfermedad. Existen ya modos de evaluar a través de la PCR el riesgo de padecer dolencias tales como diabetes de tipo I y la enfermedad celiaca.
4.Inoculaciones en el Embrion de Pollo: En las inoculaciones animals, los más utilizados son los embriones de pollo (huevos de gallina fecundados). Los huevos fecundados se incuban hasta el momento de su inoculación que suele oscilar entre 6 y 14 días. Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrión, requieren experiencia para su realización. La inoculación en la cavidad amniótica es las más utilizada para el aislamiento de virus a partir de muestras clínicas. Este sistema es el más adecuado para el aislamiento de los virus de la gripe.
5.ELISA Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre. Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes. Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes: 1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la técnica. 2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antígeno, el exceso dará lugar a una reacción falsa negativa. 3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubación para evitar la aparición de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo y el color no será evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo antígeno-anticuerpo tampoco se completará en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las proteínas (antígeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos. 4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.
6.Inhibicion de Hemaglutinacion La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígenopor el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
7.Técnica de transferencia (blotting) Se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda.
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL 1. Métodos para detectar virus. 1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico. • Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple. • Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus. El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares. Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica. Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga). 1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células. 1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
Inmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%. Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas. Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%.
Tiempo de procesamiento de los examenes: La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales. Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral. Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus). Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos. Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación. Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
889000 YOSIARA BERNARD M D6.Inhibicion de Hemaglutinacion La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígenopor el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda.
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL
Métodos para detectar virus.
Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.
• Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga).
Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células.
Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
Inmunofluorescencia directa, utilizando células del paciente, como leucocitos, orina o mucosa oral o genital, para buscar virus.
DIAPOSITIVA # 2 2-Cultivo de tejidos, Efecto Citopaticos y Cuerpos de Inclusion:
Cultivos celulares: Se denomina cultivo celular a la multiplicación y mantenimiento de células in vitro Las células se obtienen de un fragmento de un órgano como el riñón, el pulmón u otros, por trituración y posterior disgregación con tripsina, lo que permite obtener células aisladas que se introducen en frascos con medios de cultivo adecuados. Los cultivos celulares, por tanto, están formados por células disgregadas que han perdido su organización tisular, a diferencia de los cultivos de tejidos u órganos en que se conserva esa estructura. Las células en los frascos pueden estar en suspensión, es decir, libres en el medio de cultivo líquido o adosadas a la pared del frasco, como unas baldosas, y bañadas por el medio. En el primer caso se trata de células en suspensión y en el segundo en monocapa. Se denomina cultivo celular primario en suspensión o monocapa, al obtenido a partir de las células normales de un órgano de un animal adulto. Estas células se mantienen vivas algún tiempo en el cultivo, pero no pueden propagarse in vitro. Se denominan líneas celulares o cultivos celulares de línea a los que tras la obtención de las células de un órgano o tejido pueden propagarse posteriormente in vitro. Existen varios tipos de células de línea, como las de tejidos embrionarios, que sólo permiten alrededor de 50 subcultivos y mueren y las células de tejidos neoplásicos, que se propagan indefinidamente y se denominan líneas celulares continuas, confirmándose este hecho cuando se han propagado durante más de 70 pases. Los virus o las muestras clínicas se inoculan a estos cultivos celulares. Según el virus que se pretende aislar se utiliza uno u otro sistema celular.
Acción citopática: Se denomina acción citopática la lesión que causan algunos virus a las células en que se replican. Las lesiones celulares pueden ser intensas y precoces, produciendo en 24 o 48horas la muerte celular, acompañada de lisis fácilmente observable al inspeccionar los cultivos celulares con un microscopio. En otras ocasiones las alteraciones morfológicas que se producen en las células son mínimas o tardías y muy difíciles de detectar. En las células infectadas por determinados virus pueden observarse cuerpos de inclusión, acompañando a las alteraciones celulares más o menos importantes. Los cuerpos de inclusión pueden visualizarse, después de la tinción de las células con hematoxilina eritrosina, como masas con morfología más o menos característica y localización nuclear o citoplasmática típica, según los virus que los originan. Están constituidos por acúmulos del material vírico sintetizado depositados en zonas celulares alteradas; en ocasiones predomina o es exclusivo el depósito de material vírico y en otras lo prominente o exclusivo es la lesión celular. El aspecto particular y característico de cada tipo de inclusión suele orientar sobre el grupo de virus que la produce. La formación de cuerpos de inclusión ocurre tanto in vivo, en las infecciones naturales, como en los cultivos celulares infectados. Ya se ha señalado que, aparte de la acción citopática directa, la lesión de las células infectadas por un virus puede deberse a la respuesta inmune dirigida contra antígenos codificados por el virus y expresados en la superficie celular.
Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales. Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral. Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus). Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida.
Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos. Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
.ELISA Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre. Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes. Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes: 1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la técnica. 2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antígeno, el exceso dará lugar a una reacción falsa negativa. 3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubación para evitar la aparición de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo y el color no será evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo antígeno-anticuerpo tampoco se completará en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las proteínas (antígeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos. 4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.
Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
Preparación para el examen No se necesita ninguna preparación especial.
Lo que se siente durante el examen Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil.
Razones por las que se realiza el examen Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Valores normales Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen. • ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
.Técnica de transferencia (blotting) Se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped. DIAGNOSTICO VIRAL 1. Métodos para detectar virus. 1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico. • Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple. • Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus. El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares. Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica. Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga). 1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células. 1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
Pruebas diagnósticas Inmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%. Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas. Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%. Tiempo de procesamiento de los examenes: La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
Efecto citopático Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones. Cambios morfológicos Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales. Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral. Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral. Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus). Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos. Inhibición de Hemaglutinación Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación. Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
ELISA Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre. Forma en que se realiza el examen La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción. La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente. Preparación para el examen No se necesita ninguna preparación especial. Lo que se siente durante el examen Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil. Razones por las que se realiza el examen Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes. Valores normales Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen. • ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
yessenia severino sanchez mat:89206 DIAGNÓSTICO DE LAS VIROSIS
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL 1. Métodos para detectar virus. 1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico. • Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple. • Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus. El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares. Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica. Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga). Cultivo de tejidos vegetales
Cultivo in-vitro de tejidos de Physcomitrella patens en placas de Petri con agar. En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales. Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
yessenia severino sanchez mat:89204 Efecto citopático Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales. Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral. Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus). Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus. Reacción en cadena de la polimerasa
Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad.
El uso de nuevas técnicas rápidas para el diagnóstico de virus respiratorios permite optimizar el manejo clínico de los pacientes, evita el uso innecesario de antibióticos y permite la adopción de medidas para evitar la trasmisión viral. Si bien no es posible ni necesario realizar diagnóstico virológico en todos los pacientes, el uso de estas técnicas también posibilita realizar una vigilancia que permite conocer cuales son los virus circulantes en un período dado, proporcionando una base epidemiológica que permite realizar diagnósticos clínicos más precisos.
ResponderEliminarEl diagnóstico etiológico de virus influenza se realiza a partir de una muestra de hisopado nasofaríngeo o un aspirado nasofaríngeo. Esta muestra debe contener células suficientes que aseguren la pesquisa del virus influenza A o B.
Pruebas diagnósticas
ResponderEliminarInmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%.
Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas.
Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%.
Tiempo de procesamiento de los examenes:
La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.
ResponderEliminara reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
ResponderEliminarEsta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
ResponderEliminarELISA
ResponderEliminarEs el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen
La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
Preparación para el examen
No se necesita ninguna preparación especial.
Lo que se siente durante el examen
Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil.
Razones por las que se realiza el examen
Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Valores normales
Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen.
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:
ResponderEliminarSi se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Nombre: Maribel Matos. Matrícula: 87166
ResponderEliminarDIAGNÓSTICO DE LAS VIROSIS
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL
1. Métodos para detectar virus.
1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus.
• Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus.
• Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.
• Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga).
1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células.
1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
1.4. Inmunofluorescencia directa, utilizando células del paciente, como leucocitos, orina o mucosa oral o genital, para buscar virus.
1.5. Detección de ácidos nucleicos virales por reacción de polimerasa en cadena, las cuales permiten amplificar una porción pequeña de ácido nucleico en un período de tiempo corto.
Nombre: Maribel Matos. Matrícula: 87166
ResponderEliminarCultivo de tejidos vegetales
Cultivo in-vitro de tejidos de Physcomitrella patens en placas de Petri con agar.
En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.
Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
Nombre: Maribel Matos. Matrícula: 87166
ResponderEliminarEfecto citopático
Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.
Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral.
Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus).
Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
Sincitios: Los sincitios son grupos de células fusionadas apreciables como una masa celular multinucleada. La inducción de sincitios se ha observado en la infección por VIH, en concreto por variantes virales muy patogénicas que surgen en etapas tardías de la enfermedad, por lo que tienen valor pronóstico. Igualmente, es una característica frecuente en el virus sincitial respiratorio (que lleva su nombre precisamente por este fenómeno). Su observación generalmente se ha realizado en células en cultivo, pero dicho fenómeno permite in vivo la infección de nuevos linfocitos T CD4+ sin la parte extracelular del ciclo, en la que son más vulnerables a la respuesta humoral.
Nombre: Maribel Matos. Matrícula: 87166
ResponderEliminarReacción en cadena de la polimerasa
Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Fundamento e importancia
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980.
Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).
Termociclador: aparato en el que se efectúa la PCR convencional.
Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos carecían de este sistema y solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos.
Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Nombre: Maribel Matos. Matrícula: 87166
ResponderEliminarInhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
El mayor inconveniente de la prueba es el hecho de que otros componentes del suero de los pacientes, además de los anticuerpos, pueden a su vez inhibir la hemaglutinación, se denominan inhibidores inespecíficos los cuales deben ser eliminados antes de realizar la prueba.
Nombre: Maribel Matos. Matrícula: 87166
ResponderEliminarElisa
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:
-En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.
-En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.
-En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.
En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnostico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Nombre: Maribel Matos. Matrícula: 87166
ResponderEliminarContinuación:
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la técnica.
2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antígeno, el exceso dará lugar a una reacción falsa negativa.
3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubación para evitar la aparición de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo y el color no será evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo antígeno-anticuerpo tampoco se completará en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las proteínas (antígeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos.
4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.
Nombre: Maribel Matos. Matrícula: 87166
ResponderEliminarTipos de ensayos ELISA
Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.
• ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado).
• ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran variedad de antígenos, por eso es un método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión por tener un eslabón más con respecto al método directo. La dilución de la solución que contiene el anticuerpo primario (por ejemplo: suero sanguíneo) es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparición de falsos negativos, ya que si la muestra está muy diluida no saldrá positiva si la titulación de anticuerpos es muy baja. Es decir, aunque los anticuerpos están presentes, la prueba no da positivo porque la concentración de anticuerpos específicos contra el antígeno que está pegado en el fondo del pocillo no es suficiente como para dar una señal detectable.
El ELISA indirecto es el método de elección para detectar la presencia de anticuerpos séricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Según esta técnica, proteínas recombinantes de la envoltura y el núcleo del VIH se absorben como antígenos en fase sólida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos séricos contra epítopos en estas proteínas víricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos séricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infección.
• ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
88402
ResponderEliminar1-DIAGNÓSTICO DE LAS VIROSIS
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL
1. Métodos para detectar virus.
1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus.
• Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus.
• Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.
• Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga).
1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células.
1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
88402
ResponderEliminar2-Pruebas diagnósticas
Inmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%.
Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas.
Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%.
Tiempo de procesamiento de los examenes:
La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
88402
ResponderEliminar3-Efecto citopático
Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.
Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral.
Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus).
Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
88402
ResponderEliminar4-a reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
88402
ResponderEliminar5-La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
88402
ResponderEliminar6-ELISA
Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen
La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
Preparación para el examen
No se necesita ninguna preparación especial.
Lo que se siente durante el examen
Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil.
Razones por las que se realiza el examen
Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Valores normales
Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen.
• ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
88402
ResponderEliminar7-La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:
Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Nombre: Zaida Acta. Matrícula: 86624
ResponderEliminarDIAGNOSTICO VIRAL
1. Métodos para detectar virus.
1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus.
• Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus.
• Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.
• Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
Nombre: Zaida Acta. Matrícula: 86624
ResponderEliminarCultivo de tejidos vegetales
En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.
Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética,mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
Iniciación
El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas, con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza, dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán a partir del explanto original dependen de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como tallos, raíces, bulbos u otros órganos. Estos tejidos cultivados in vitro se hallan dentro de un microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico, protegidos del medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo, que pueda entrar al mismo, crecerá de forma oportunista a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos.
Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es «cultivar los tejidos», deben proveerse además ciertos requerimientos externos: los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o pueden colocarse en un medio líquido.
Los tejidos también necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y una mezcla de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares.
Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo, en general, es necesario el suministro de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio de cultivo, más que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios altos niveles de luz.
Nombre: Zaida Acta. Matrícula: 86624
ResponderEliminarReacción en cadena de la polimerasa
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Nombre: Zaida Acta. Matrícula: 86624
ResponderEliminarFundamento e importancia
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980.
Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas demicroorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).
Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos carecían de este sistema y solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o con un poco decera dentro de los tubos.
Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Nombre: Zaida Acta. Matrícula: 86624
ResponderEliminarInhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
El mayor inconveniente de la prueba es el hecho de que otros componentes del suero de los pacientes, además de los anticuerpos, pueden a su vez inhibir la hemaglutinación, se denominan inhibidores inespecíficos los cuales deben ser eliminados antes de realizar la prueba.
Nombre: Zaida Acta. Matrícula: 86624
ResponderEliminarElisa
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:
-En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.
-En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.
-En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.
En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnostico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
Nombre: Zaida Acta. Matrícula: 86624
ResponderEliminarFases de un ensayo ELISA
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la técnica.
2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antígeno, el exceso dará lugar a una reacción falsa negativa.
3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubación para evitar la aparición de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo y el color no será evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo antígeno-anticuerpo tampoco se completará en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las proteínas (antígeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos.
4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.
2012-0249
ResponderEliminar2012-0249
ResponderEliminarLa virología (rama de la microbiologia) es el estudio de los virus: su estructura, clasificación y evolución, su manera de infectar y aprovecharse de las células huésped para la reproducción del virus, su interacción con los organismos huéspedes, su inmunidad, la enfermedad que causan, las técnicas para su aislamiento, cultivo y su uso en investigación y terapia. La virología es considerada un sub-campo de la microbiología y la medicina. La virologia también es una rama taxonómica de la biología para estudiar los virus y todos sus componentes.
Su investigación incluye:
la replicación viral
los patógenos virales.
la inmunología viral.
las vacunas virales.
los métodos de diagnóstico.
la quimioterapia antiviral.
las medidas de control de una infección.
los diferentes signos que manifiestan la presencia de virus.
Este comentario ha sido eliminado por un administrador del blog.
ResponderEliminarEste comentario ha sido eliminado por un administrador del blog.
ResponderEliminarEste comentario ha sido eliminado por un administrador del blog.
ResponderEliminarEste comentario ha sido eliminado por un administrador del blog.
ResponderEliminarEste comentario ha sido eliminado por un administrador del blog.
ResponderEliminarEste comentario ha sido eliminado por un administrador del blog.
ResponderEliminarEste comentario ha sido eliminado por un administrador del blog.
ResponderEliminarEste comentario ha sido eliminado por un administrador del blog.
ResponderEliminarEste comentario ha sido eliminado por un administrador del blog.
ResponderEliminarEste comentario ha sido eliminado por un administrador del blog.
ResponderEliminarEste comentario ha sido eliminado por un administrador del blog.
ResponderEliminarEste comentario ha sido eliminado por el autor.
ResponderEliminarLos virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
ResponderEliminarDIAGNOSTICO VIRAL
1. Métodos para detectar virus.
1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus.
• Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus.
• Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.
• Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga).
1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células.
1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
-Pruebas diagnósticas
ResponderEliminarInmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%.
Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas.
Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%.
Tiempo de procesamiento de los examenes:
La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
Efecto citopático
ResponderEliminarSe denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.
Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral.
Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus).
Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
ResponderEliminarInhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
ELISA
ResponderEliminarEs el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen
La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
Preparación para el examen
No se necesita ninguna preparación especial.
Lo que se siente durante el examen
Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil.
Razones por las que se realiza el examen
Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Valores normales
Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen.
• ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:
ResponderEliminarSi se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
El uso de nuevas técnicas rápidas para el diagnóstico de virus respiratorios permite optimizar el manejo clínico de los pacientes, evita el uso innecesario de antibióticos y permite la adopción de medidas para evitar la trasmisión viral. Si bien no es posible ni necesario realizar diagnóstico virológico en todos los pacientes, el uso de estas técnicas también posibilita realizar una vigilancia que permite conocer cuales son los virus circulantes en un período dado, proporcionando una base epidemiológica que permite realizar diagnósticos clínicos más precisos.
ResponderEliminarEl diagnóstico etiológico de virus influenza se realiza a partir de una muestra de hisopado nasofaríngeo o un aspirado nasofaríngeo. Esta muestra debe contener células suficientes que aseguren la pesquisa del virus influenza A o B.
mat:89206
Pruebas diagnósticas
ResponderEliminarInmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%.
Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas.
Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%.
Tiempo de procesamiento de los examenes:
La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas
mat:89206
En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.
ResponderEliminara reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
mat:89206
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos
ResponderEliminarmat:89206
ELISA
ResponderEliminarEs el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen
La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
Preparación para el examen
No se necesita ninguna preparación especial.
Lo que se siente durante el examen
Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil.
Razones por las que se realiza el examen
Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Valores normales
Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen.
mat:89206
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:
ResponderEliminarSi se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
mat:89206
Diapositiva1
ResponderEliminarDIAGNÓSTICO DE LAS VIROSIS
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL
1. Métodos para detectar virus.
1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus.
• Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus.
• Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.
• Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga).
1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células.
1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
1.4. Inmunofluorescencia directa, utilizando células del paciente, como leucocitos, orina o mucosa oral o genital, para buscar virus.
1.5. Detección de ácidos nucleicos virales por reacción de polimerasa en cadena, las cuales permiten amplificar una porción pequeña de ácido nucleico en un período de tiempo corto.
Diapositiva2
ResponderEliminarCultivo de tejidos vegetales
Cultivo in-vitro de tejidos de Physcomitrella patens en placas de Petri con agar.
En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.
Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
Diapositiva3
ResponderEliminarEfecto citopático
Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.
Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral.
Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus).
Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
Sincitios: Los sincitios son grupos de células fusionadas apreciables como una masa celular multinucleada. La inducción de sincitios se ha observado en la infección por VIH, en concreto por variantes virales muy patogénicas que surgen en etapas tardías de la enfermedad, por lo que tienen valor pronóstico. Igualmente, es una característica frecuente en el virus sincitial respiratorio (que lleva su nombre precisamente por este fenómeno). Su observación generalmente se ha realizado en células en cultivo, pero dicho fenómeno permite in vivo la infección de nuevos linfocitos T CD4+ sin la parte extracelular del ciclo, en la que son más vulnerables a la respuesta humoral.
Diapositiva4
ResponderEliminarReacción en cadena de la polimerasa
Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Fundamento e importancia
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980.
Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).
Termociclador: aparato en el que se efectúa la PCR convencional.
Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos carecían de este sistema y solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos.
Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Diapositiva5
ResponderEliminarInhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
El mayor inconveniente de la prueba es el hecho de que otros componentes del suero de los pacientes, además de los anticuerpos, pueden a su vez inhibir la hemaglutinación, se denominan inhibidores inespecíficos los cuales deben ser eliminados antes de realizar la prueba.
Diapositiva6
ResponderEliminarElisa
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:
-En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.
-En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.
-En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.
En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnostico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Diapositiva7
ResponderEliminarContinuación:
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la técnica.
2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antígeno, el exceso dará lugar a una reacción falsa negativa.
3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubación para evitar la aparición de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo y el color no será evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo antígeno-anticuerpo tampoco se completará en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las proteínas (antígeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos.
4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.
Diapositiva8
ResponderEliminarTipos de ensayos ELISA
Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.
• ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado).
• ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran variedad de antígenos, por eso es un método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión por tener un eslabón más con respecto al método directo. La dilución de la solución que contiene el anticuerpo primario (por ejemplo: suero sanguíneo) es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparición de falsos negativos, ya que si la muestra está muy diluida no saldrá positiva si la titulación de anticuerpos es muy baja. Es decir, aunque los anticuerpos están presentes, la prueba no da positivo porque la concentración de anticuerpos específicos contra el antígeno que está pegado en el fondo del pocillo no es suficiente como para dar una señal detectable.
El ELISA indirecto es el método de elección para detectar la presencia de anticuerpos séricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Según esta técnica, proteínas recombinantes de la envoltura y el núcleo del VIH se absorben como antígenos en fase sólida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos séricos contra epítopos en estas proteínas víricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos séricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infección.
• ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
Caroleny Cespedes Zorrilla 87997
ResponderEliminarDiapositiva 1
Tema: Diagnostico de las virosis
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL
Métodos para detectar virus.
Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus.
• Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus.
• Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.
• Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga).
Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células.
1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
Caroleny Cespedes Zorrilla 87997
ResponderEliminarDiapositiva 2
Tema: Cultivo de los tejidos
Cultivo in-vitro de tejidos de Physcomitrella patens en placas de Petri con agar.
En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.
Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
Caroleny Cespedes Zorrilla 87997
ResponderEliminarDiapositiva 3
Tema: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Fundamento e importancia
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980.
Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).
Termociclador: aparato en el que se efectúa la PCR convencional.
Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos carecían de este sistema y solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos.
Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Caroleny Cespedes Zorrilla 87997
ResponderEliminarDiapositiva 4
Tema: Inoculaciones en el embrion del pollo
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
Caroleny Cespedes Zorrilla 87997
ResponderEliminarDiapositiva 5
Tema: Inhibicion de la hemaglutinacion
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Caroleny Cespedes Zorrilla 87997
ResponderEliminarDiapositiva 6
Tema: Elisa
Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen
La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
Preparación para el examen
No se necesita ninguna preparación especial.
Lo que se siente durante el examen
Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil.
Razones por las que se realiza el examen
Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Valores normales
Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen.
Caroleny Cespedes Zorrilla 87997
ResponderEliminarDiapositiva 7
Tema: Tecnica de blotting
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:
Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Matricula 75596
ResponderEliminarDiagnostico de la virosis.
Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, según persigan demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos específicos por parte del huésped en el curso de la infección.
Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico clínico se basan en pruebas serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas. Sin embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten precozmente la infección viral (tratamientos específicos, medidas profilácticas, etc.).
En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia de antígenos virales previamente al desarrollo de la seroconversión, siendo esta prueba la única evidencia de la exposición al virus cuando no existe aumento de los niveles de anticuerpos circulantes (pacientes inmunodeprimidos).
Igualmente la detección del genoma viral puede favorecer la precocidad del diagnóstico viral y su confirmación. En la última década se han desarrollado una serie de técnicas para el diagnóstico viral basadas en la detección de ácidos nucleicos. De ellas la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más utilizada.
En el momento actual, la tendencia en el diagnóstico virológico consiste en emplear nuevas y más sensibles tecnologías de detección de antígenos y de investigación de ácidos nucleicos con el propósito de lograr un diagnóstico viral más rápido. El desarrollo de quimioterapia antiviral efectiva es responsable de esta tendencia que hace de la identificación rápida, sensible y específica de los virus, una necesidad.
Luis E. Ametller 89066
ResponderEliminar1 Diagnostico de las virosis
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL
Métodos para detectar virus.
1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus.
• Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus.
• Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.
• Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga).
1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células.
1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
Luis E. Ametller 89066
ResponderEliminar2 Cultivo de los tejidos
Cultivo in-vitro de tejidos de Physcomitrella patens en placas de Petri con agar.
En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.
Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
Luis E. Ametller 89066
ResponderEliminar3 Reacción en cadena de la polimerasa
Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Fundamento e importancia
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980.
Luis E. Ametller 89066
ResponderEliminar4 Inoculaciones en el embrion del pollo
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
Luis E. Ametller 89066
ResponderEliminar5 Inhibicion de la aglutinacion
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Luis E. Ametller 89066
ResponderEliminarTecnica de blotting
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:
Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Slide# 1
ResponderEliminarLas virosis son enfermedades de fácil contagio producidas por virus. Estos son agentes patógenos muy pequeños, seres vivos tan diminutos que sólo pueden verse con microscopios electrónicos, que pueden infectar células y provocar infecciones. Se multiplican con extraordinaria rapidez.
Los virus según el tejido que ataquen, se clasifican en:
• Dermatrópicos, si afectan la piel.
• Pneumotrópicos, si afectan los pulmones.
• Neurotrópicos, si afectan el sistema nervioso.
• Viscerotrópicos, si afectan las vísceras y órganos internos.
Los virus tienen diferentes maneras de transmitirse, algunos lo hacen por el aire, como los de la gripe, paperas, viruela, varicela. El virus de la rabia se trasmite por la saliva del animal infectado. Otros se transmiten por la picadura de mosquitos, como los que producen la fiebre amarilla y el dengue hemorrágico. Otros lo hacen por medio del agua o de alimentos contaminados.
Slide#2
ResponderEliminarMuchos virus inhiben la síntesis de ARN, ADN o proteica del huésped. Los mecanismos a trav’es de los cuales logran esta inhibición son muy diversos.
Efecto citopático (CPE)
La presencia del virus con frecuencia implica cambios morfológicos en la célula huésped. Cualquier cambio detectable en la célula huésped provocado por infección se conoce como efecto citopático. Los efectos citopáticos pueden consistir en redondeamiento, desorientación, edematización o encogimiento, muerte, despegamiento de la superficie, etc.
Muchos virus inducen apoptosis (muerte celular programada) en las células infectadas. Esto puede ser parte importante de los mecanismos de defensa antivirales de la célula huésped – la muerte celular antes de completarse en ciclo viral replicativo puede limitar la progenie y la difusión de la infección. (Algunos virus endentecen o previenen la apoptosis – dando a sí mismos más oportunidad de replicar más viriones).
Algunos virus afectan la regulación de la expresión de los genes de la célula huésped, lo que puede tener consecuencias importantes tanto en la habilidad del virus de crecer, como en la célula huésped per se.
Los efectos citopáticos producidos por diferentes virus dependen del virus mismo y de la célula en la que se incorporan. Esto puede ser de utilidad en los laboratorios clínicos de virología par ayudar en la identificación de virus aislados.
Slide#3
ResponderEliminarLa reacción en cadena de la polimerasa, ya más conocida como PCR, es una técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN. Uno de los aportes fundamentales de esta metodología a la investigación básica en biología molecular consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante las cuales se realiza una tarea que antes requería largas y tediosas ¡ornadas. El producto que se obtiene al finalizar la reacción -una gran cantidad de un fragmento génico con alto grado de pureza- favorece la tarea de los investigadores empeñados en ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y función de los genes. Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificación de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el análisis de muestras del niño y de su abuela materna. Entre las aplicaciones médicas de la PCR cabe destacar su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico.
Slide#4 y 5
ResponderEliminarLos mas utilizados son los embriones de pollo.los huevos fecundados se incuban hasta el momento de su inoculación que suele oscilar entre 6 y 14 días. Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrión (cavidad amniótica, saco vitelino, etc.)
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Slide#6 y 7
ResponderEliminarELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante unanticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnóstico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
Diagnostico de Laboratorio
ResponderEliminarSlide 1: Diagnostico de Laboratorio 2012-0593
El diagnóstico virológico comprende la detección e identificación del agente
etiológico de una infección viral, clínica o inaparente, y /o de la respuesta inmune
específica del huésped.
La primera etapa la constituye el diagnóstico viral clínico, que generalmente tiene
un carácter de orientación. Se basa principalmente en el cuadro clínico y
considera los antecedentes personales y familiares, además de la situación
epidemiológica; a menudo se recurre además al laboratorio clínico general. En
muchas circunstancias este diagnóstico clínico puede ser suficiente, como en
sarampión, hepatitis, varicela, etc. Sin embargo, cada día se observa con mayor
frecuencia la asociación de virus con diversos cuadros clínicos, incluso muy
severos, en los que el estudio específico de laboratorio virológico se hace
indispensable como medio diagnóstico, de control evolutivo, con fines
epidemiológicos, etc. Hoy día, el avance de las técnicas diagnósticas ha
demostrado que hasta los cuadros más típicamente asignados a una etiología
pueden ser causados por otros agentes: las enfermedades son realmente
síndromes.
Las aplicaciones del diagnóstico virológico son variadas y dependen de los medios
disponibles y de las circunstancias que ameriten un diagnóstico etiológico
específico. En salud pública se utiliza habitualmente en programas de vigilancia
epidemiológica (ej: poliomielitis, influenza, hantavirus, VIH, etc.) y en el control de
vacunas mediante censos serológicos, como polio, parotiditis y sarampión. En
medicina curativa la necesidad del diagnóstico virológico alcanza a todas las
disciplinas: pediatría, obstetricia, medicina, cirugía, dermatología, etc. El aumento
de la población de inmunocomprometidos ha creado nuevos problemas por la
aparición de cuadros clínicos atípicos y la emergencia de nuevas cepas
microbianas. El gran desarrollo de las técnicas de diagnóstico virológico ha
permitido ofrecer actualmente una ayuda directa al médico clínico y ha facilitado
la investigación en salud, posibilitado su aplicación en muchos campos.
Actualmente el médico clínico puede tratar con nuevos antivirales y controlar el
curso de muchas infecciones virales, como SIDA, hepatitis B o C, etc. En el presente
existe comercialmente una gran variedad de técnicas que pueden implementarse
en laboratorios clínicos, por lo que se requiere conocer sus características para
seleccionar las de mayor aplicabilidad.
El diagnóstico definitivo requiere un análisis de correlación entre los antecedentes
clínicos personales, familiares, epidemiológicos y los resultados del laboratorio
virológico, considerando la oportunidad y calidad de la muestra, las propiedades
de las técnicas utilizadas y la experiencia acumulada al respecto. La conclusión
final depende entonces de un trabajo profesional multidisciplinario, más que de
una cifra aportada por una moderna máquina automatizada.
Slide 2: Cultivo de tejidos, Efecto Citopatico, Cuerpos de Inclusion 2012-0593
ResponderEliminarCultivo in-vitro de tejidos de Physcomitrella patens en placas de Petri con agar.
En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales. Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral.
Sincitios: Los sincitios son grupos de células fusionadas apreciables como una masa celular multinucleada. La inducción de sincitios se ha observado en la infección por VIH, en concreto por variantes virales muy patogénicas que surgen en etapas tardías de la enfermedad, por lo que tienen valor pronóstico. Igualmente, es una característica frecuente en el virus sincitial respiratorio (que lleva su nombre precisamente por este fenómeno). Su observación generalmente se ha realizado en células en cultivo, pero dicho fenómeno permite in vivo la infección de nuevos linfocitos T CD4+ sin la parte extracelular del ciclo, en la que son más vulnerables a la respuesta humoral.
Slide 3: Reaccion de cadena polimerasa (PCR) 2012-0593
ResponderEliminarLa reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular que permite la rápida replicación del ADN. Con la PCR, cantidades mínimas de material genético pueden ser amplificadas millones de veces en pocas horas permitiendo la detección rápida y fiable de los marcadores genéticos de enfermedades infecciosas, cáncer y desórdenes genéticos.
El uso de la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa ha aumentado mucho la capacidad de los científicos para estudiar el material genético. Desde su invención por científicos de Cetus Corporation en 1983, la PCR ha cambiado la forma en la que se lleva a cabo la investigación y diagnóstico médico. La capacidad de producir rápidamente grandes cantidades de material genético ha permitido avances científicos significativos, incluyendo huella dactilar del ADN y la secuenciación el genoma humano. Además, la tecnología PCR ha influido mucho en los campos del diagnostico de la enfermedad y manejo del paciente, particularmente en las áreas de SIDA y hepatitis C.
La PCR está diseñada según el principio natural de replicación del ADN. Es un proceso de tres pasos, designado como un ciclo, que se repite un número específico de veces.
Un ciclo de PCR consiste en los siguientes pasos:
1. Desnaturalización
2. Alineación
3. Extensión
Este proceso tiene lugar en un termociclador, un instrumento que automáticamente controla y alterna las temperaturas durante períodos programados de tiempo para el número apropiado de ciclos de PCR (generalmente entre 30 y 40 ciclos).
Paso 1º PCR: Desnaturalización por calor.
El calor (generalmente > 90°C) separa la doble hebra de ADN en dos filamentos, esto se conoce como “desnaturalización".
Puesto que los enlaces del hidrógeno que unen las bases de uno a otro son débiles, se rompen a altas temperaturas, mientras que los enlaces entre fosfatos y desoxirribosa, que son enlaces covalentes más fuertes, permanecen intactos.
Slide 3: Reaccion de cadena polimerasa (PCR) 2012-0593
ResponderEliminarCiclo PCR - Paso 1º: Desnaturalización por calor
Ciclo PCR - Paso 1º: Desnaturalización por calor.
Paso 2º PCR: Alineación – unión de la sonda a la secuencia diana.
El objetivo no es replicar la hebra entera de ADN sino replicar la secuencia diana de aproximadamente 100-600 pares de bases que es única en el organismo.Los iniciadores marcan el final de la secuencia diana: éstos son sintéticos y cortos, creados a partir de una hebra única de ADN y que normalmente constan de 20-30 bases, con una marca de biotina 5’ al final para ayudar a la detección.
Two primers are included in the PCR, one for each of the complementary single DNA strands that was produced during denaturation. The beginning of the DNA target sequence of interest is marked by the primers that anneal (bind) to the complementary sequence.
Temperatura de Alineación: generalmente ocurre entre 40°C y 65°C, dependiendo de la longitud y la secuencia de bases de los iniciadores. Permite que éstos se unan a la secuencia diana con alta especificidad.
Ciclo PCR - Paso 2º: Un par de iniciadores biotinilados se unen al final de la secuencia diana
Ciclo PCR - Paso 2º: Un par de iniciadores biotinilados se unen al final de la secuencia diana.Paso 3º PCR: Extensión
Una vez que los iniciadores se han unido a las secuencias complementarias de ADN, la temperatura se eleva aproximadamente a 72°C y la enzima Taq polimerasa replica los filamentos de ADN.
La Taq ADN polimerasa es una ADN polimerasa recombinante termoestable del organismo Thermus aquaticus, que a diferencia de otras polimerasas se mantiene activa a elevada temperatura. Comienza el proceso de síntesis en la región marcada por los iniciadores y sintetiza una nueva hélice de ADN de doble hebra, ambas idénticas al original, para facilitar la unión de los nucleótidos complementarios que quedan libres en la solución (dNTPs).
La extensión comienza siempre en el extremo 3' del iniciador creando una doble tira a partir de cada una de las hebras individuales. La Taq ADN polimerasa sintetiza exclusivamente en la dirección 5’ a 3’. No obstante los nucleótidos libres en la solución sólo se añaden al extremo 3`del iniciador, construyendo la tira complementaria de la secuencia de ADN.
Ciclo PCR - Paso 3º: La Taq ADN polimerasa cataliza la extensión de los iniciadores de modo complementario. Se incorporan los nucleótidos
Ciclo PCR - Paso 3º: La Taq ADN polimerasa cataliza la extensión de los iniciadores de modo complementario. Se incorporan los nucleótidos
Final del primer ciclo de PCR
Al final del primer ciclo de PCR, nos encontramos dos nuevas tiras de ADN idénticas al original.
Punto final: La ADN polimerasa no reconoce el final de la secuencia. Las nuevas hebras formadas tienen un principio, definido precisamente por el extremo 5’ del iniciador, aunque el extremo 3' no queda definido.
Mientras que el número de ciclos aumenta, una hebra con una longitud más definida sirve como plantilla para la nueva secuencia sintetizada.
La hebra de ADN sintetizada a partir esta plantilla tiene una longitud definida que está limitada por el extremo 5’ de cada uno de los dos iniciadores. Estas hebras de ADN se denominan AMPLICONES.
Después de algunos ciclos, las hebras de DNA que corresponden a la secuencia diana, están presentes en un número mucho mayor que las secuencias de longitud variable.
En otras palabras la secuencia flanqueada o definida por los dos iniciadores es la sección que se amplifica.
Slide 5: Inhibicion de la Hemaglutinacion 2012-0593
ResponderEliminarSe denomina aglutinación a la interacción in vitro de un antígeno particulado ( por lo general células) con su anticuerpo específico.
Hemoaglutinación es la propiedad que tienen ciertos virus para unir y aglutinar eritrocitos de mamíferos y aves, debido a las proteínas que poseen en su capa externa Esta hemoaglutinación inducida por virus puede usarse para facilitar la identificación de un virus desconocido.La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Slide 6:ELISA 2012-0593
Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen: La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
No se necesita ninguna preparación especial.
Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil.
Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen.
Significado de los resultados anormales
Los valores anormales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. En algunas personas, un resultado positivo puede ser normal.
Slide 7: Tecnicas analíticas de Blotting 2012-0593
ResponderEliminarLa técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:
Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
diana alexandra santana vasquez89309
ResponderEliminardiapositiva#1
DIAGNÓSTICO DE LAS VIROSIS
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL
Métodos para detectar virus.
Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus.
• Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus.
• Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.
• Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga).
Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células.
Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
Inmunofluorescencia directa, utilizando células del paciente, como leucocitos, orina o mucosa oral o genital, para buscar virus.
Detección de ácidos nucleicos virales por reacción de polimerasa en cadena, las cuales permiten amplificar una porción pequeña de ácido nucleico en un período de tiempo corto.
diana alexandra santana vasquez89309
ResponderEliminardiapositiva#2
Cultivo de tejidos
En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.
Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética,mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
Iniciación
El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas, con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza, dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán a partir del explanto original dependen de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como tallos, raíces, bulbos u otros órganos. Estos tejidos cultivados in vitro se hallan dentro de un microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico, protegidos del medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo, que pueda entrar al mismo, crecerá de forma oportunista a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos.
Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es «cultivar los tejidos», deben proveerse además ciertos requerimientos externos: los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o pueden colocarse en un medio líquido.
Los tejidos también necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y una mezcla de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares.
Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo, en general, es necesario el suministro de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio de cultivo, más que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios altos niveles de luz.
diana alexandra santana vasquez89309
ResponderEliminardiapositiva#3
Reacción en cadena de la polimerasa
Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Fundamento e importancia
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980.
Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo.
Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos.
Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).
Termociclador: aparato en el que se efectúa la PCR convencional.
Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción.
Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción.
Los termocicladores más antiguos carecían de este sistema y solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos.
Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
diana alexandra santana vasquez89309
ResponderEliminardiapositiva#4
Inoculaciones en el embrion del pollo
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida.
Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
diana alexandra santana vasquez8930
ResponderEliminardiapositiva#5
nhibicion de la aglutinacion
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares.
El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida.
Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
diana alexandra santana vasquez89309
ResponderEliminardiapositiva#6
Elisa
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:
-En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.
-En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.
-En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.
En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnostico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
Pruebas diagnósticas
EliminarInmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%.
Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas.
Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%.
Tiempo de procesamiento de los examenes:
La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
diana alexandra santana vasquez89309
ResponderEliminardiapositiva#7
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:
Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar.
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda.
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Matricula -89435
ResponderEliminar*Diagnóstico de las virosis
Síntomas Los síntomas son muy variables y dependen del virus y del órgano afectado. Muchos virus, como muchas bacterias, producen fiebre y síntomas respiratorios (tos, estornudos) o intestinales (náuseas, vómito, diarrea). Las virosis, aun cuando no sean de peligro, a menudo provocan fiebre elevada en los niños de corta edad.
Diagnóstico Algunas infecciones virales, como la gripe, el resfriado común, la varicela son fáciles de identificar por sus síntomas, sin que se necesiten análisis de laboratorio. Para otras, como la hepatitis viral, el sida y la mononucleosis infecciosa, se suele analizar una muestra de sangre en busca de anticuerpos específicos contra el virus. La presencia de estos anticuerpos confirma el diagnóstico. En ciertos casos, los virus pueden cultivarse en tejidos celulares o bien el virus se identifica por su ácido nucleico, valiéndose de una técnica que recibe el nombre de reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Las pruebas como el RCP o el cultivo celular se emplean cuando las de anticuerpos no tienen la precisión suficiente o cuando es necesario cuantificar con mayor exactitud el virus invasor.
Las aplicaciones del diagnóstico virológico son variadas y dependen de los medios
disponibles y de las circunstancias que ameriten un diagnóstico etiológico
específico. En salud pública se utiliza habitualmente en programas de vigilancia
epidemiológica (ej: poliomielitis, influenza, hantavirus, VIH, etc.) y en el control de
vacunas mediante censos serológicos, como polio, parotiditis y sarampión. En
medicina curativa la necesidad del diagnóstico virológico alcanza a todas las
disciplinas: pediatría, obstetricia, medicina, cirugía, dermatología, etc.
* Efecto citopatico
Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral.
*Cuerpos de inclusión
Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus).
Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
Diapositiva 2
ResponderEliminarTema: Cultivo de los tejidos
Cultivo in-vitro de tejidos de Physcomitrella patens en placas de Petri con agar.
En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.
Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
4 Inoculaciones en el embrion del pollo
ResponderEliminarLa inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Inhibición de Hemaglutinación
ResponderEliminarEs una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
El mayor inconveniente de la prueba es el hecho de que otros componentes del suero de los pacientes, además de los anticuerpos, pueden a su vez inhibir la hemaglutinación, se denominan inhibidores inespecíficos los cuales deben ser eliminados antes de realizar la prueba.
Elisa
ResponderEliminarELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:
MATRICULA -89435
ResponderEliminar*Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica "in vitro" que imita la habilidad natural de la célula de duplicar el ADN.
Se trata de una técnica usada para crear un gran número de copias de un segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalización, apareamiento con cebadores y extensión por una ADN polimerasa termoresistente.
2. Proceso:
La mezcla de reacción se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de desnaturalización, una de hibridación o alineación y una de elongación.
a) Durante la desnaturalización, que se realiza por calentamiento de la mezcla a 95ºC, se separan las dos cadenas del ADN molde.
b) Durante la hibridación, la temperatura de incubación se reduce para permitir el apareamiento de las bases de ambos cebadores en el sitio donde encuentran una secuencia complementaria.
c) Durante la fase de elongación, la mezcla se calienta a 72ºC y la enzima Taq ADN polimerasa se usa para replicar las hebras de DNA. La Taq polimerasa comienza el proceso de extensión de la cadena complementaria a partir del extremo 3’ de los cebadores. Al finalizar cada ciclo, la cantidad de ADN molde disponible para el ciclo siguiente aumenta al doble.
Entre muchas de las aplicaciones que la PCR pone a disposición se encuentran la detección precoz o prenatal de enfermedades genéticas, la detección de infecciones virales latentes o la producción de grandes cantidades de fragmentos de ADN humano a una velocidad muy superior a la posible mediante otros métodos. Esta técnica también se aplica para estudios de identidad y filiación.
* Inoculaciones en el embrión de pollo
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida.
Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
Matricula -89435
ResponderEliminar*INHIBICION DE LA HEMAGLUTINACION
inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay)
La técnica ELISA (Análisis Inmuno Absorbente Ligado a Enzimas) Se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, puede ser medido espectrofotométricamente.
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes :
Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc.. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.
Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.
Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.
Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría. En el esquema se muestra la reacción asociada a un ELISA directo.
TIPOS DE ELISA
ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas).
ELISA indirecto.
ELISA 'sandwich'.
2011-0029 José Luis González Salas
ResponderEliminarSlide# 1
Las virosis son enfermedades de fácil contagio producidas por virus. Estos son agentes patógenos muy pequeños, seres vivos tan diminutos que sólo pueden verse con microscopios electrónicos, que pueden infectar células y provocar infecciones. Se multiplican con extraordinaria rapidez.
Los virus según el tejido que ataquen, se clasifican en:
• Dermatrópicos, si afectan la piel.
• Pneumotrópicos, si afectan los pulmones.
• Neurotrópicos, si afectan el sistema nervioso.
• Viscerotrópicos, si afectan las vísceras y órganos internos.
Los virus tienen diferentes maneras de transmitirse, algunos lo hacen por el aire, como los de la gripe, paperas, viruela, varicela. El virus de la rabia se trasmite por la saliva del animal infectado. Otros se transmiten por la picadura de mosquitos, como los que producen la fiebre amarilla y el dengue hemorrágico. Otros lo hacen por medio del agua o de alimentos contaminados.
2011-0029 José Luis González Salas
ResponderEliminarDiapositiva 2
Muchos virus inhiben la síntesis de ARN, ADN o proteica del huésped. Los mecanismos a trav’es de los cuales logran esta inhibición son muy diversos.
Efecto citopático (CPE)
La presencia del virus con frecuencia implica cambios morfológicos en la célula huésped. Cualquier cambio detectable en la célula huésped provocado por infección se conoce como efecto citopático. Los efectos citopáticos pueden consistir en redondeamiento, desorientación, edematización o encogimiento, muerte, despegamiento de la superficie, etc.
Muchos virus inducen apoptosis (muerte celular programada) en las células infectadas. Esto puede ser parte importante de los mecanismos de defensa antivirales de la célula huésped – la muerte celular antes de completarse en ciclo viral replicativo puede limitar la progenie y la difusión de la infección. (Algunos virus endentecen o previenen la apoptosis – dando a sí mismos más oportunidad de replicar más viriones).
Algunos virus afectan la regulación de la expresión de los genes de la célula huésped, lo que puede tener consecuencias importantes tanto en la habilidad del virus de crecer, como en la célula huésped per se.
Los efectos citopáticos producidos por diferentes virus dependen del virus mismo y de la célula en la que se incorporan. Esto puede ser de utilidad en los laboratorios clínicos de virología par ayudar en la identificación de virus aislados.
2011-0029 José Luis González Salas
ResponderEliminarDiapositiva 3
La reacción en cadena de la polimerasa, ya más conocida como PCR, es una técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN. Uno de los aportes fundamentales de esta metodología a la investigación básica en biología molecular consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante las cuales se realiza una tarea que antes requería largas y tediosas ¡ornadas. El producto que se obtiene al finalizar la reacción -una gran cantidad de un fragmento génico con alto grado de pureza- favorece la tarea de los investigadores empeñados en ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y función de los genes. Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificación de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el análisis de muestras del niño y de su abuela materna. Entre las aplicaciones médicas de la PCR cabe destacar su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico.
2011-0029 José Luis González Salas
ResponderEliminarDiapositiva 4 y 5
Los mas utilizados son los embriones de pollo.los huevos fecundados se incuban hasta el momento de su inoculación que suele oscilar entre 6 y 14 días. Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrión (cavidad amniótica, saco vitelino, etc.)
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
2011-0029 José Luis González Salas
ResponderEliminarDiapositiva 6 y 7
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante unanticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnóstico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
89693 - Fabiano Lima das Gracas
ResponderEliminarVirologia – Grupo Lunes 10-12pm
1-Diagnostico de las Virosis:
En la actualidad existen métodos para detectar los virus mediante microscopía óptica. Naturalmente no permiten la visualización individualizada de los viriones, sino la presencia de grandes acúmulos de material vírico intracelular, que pueden teñirse y constituyen los denominados cuerpos de inclusión
La utilización de anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes permite detectar en las células infectadas los antígenos víricos específicos formando acúmulos o distribuidos de forma difusa.
Este tipo de observaciones puede hacerse tanto sobre tejidos humanos infectados naturalmente como sobre cultivos celulares inoculados en el laboratorio.
Aislamiento y propagación de los virus
Los virus, a diferencia de los que sucede con la mayoría de las bacterias, hongos y protozoos, sólo pueden multiplicarse en el interior de células vivas, no pudiendo hacerlo en un medio nutritivo carente de células.
Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el laboratorio son:
1. animales de experimentación
2. embriones animales
3. cultivos celulares artificiales.
89693 - Fabiano Lima das Gracas
ResponderEliminarVirologia – Grupo Lunes 10-12pm
2-Cultivo de tejidos, Efecto Citopaticos y Cuerpos de Inclusion:
Cultivos celulares:
Se denomina cultivo celular a la multiplicación y mantenimiento de células in vitro
Las células se obtienen de un fragmento de un órgano como el riñón, el pulmón u otros, por trituración y posterior disgregación con tripsina, lo que permite obtener células aisladas que se introducen en frascos con medios de cultivo adecuados. Los cultivos celulares, por tanto, están formados por células disgregadas que han perdido su organización tisular, a diferencia de los cultivos de tejidos u órganos en que se conserva esa estructura.
Las células en los frascos pueden estar en suspensión, es decir, libres en el medio de cultivo líquido o adosadas a la pared del frasco, como unas baldosas, y bañadas por el medio. En el primer caso se trata de células en suspensión y en el segundo en monocapa.
Se denomina cultivo celular primario en suspensión o monocapa, al obtenido a partir de las células normales de un órgano de un animal adulto. Estas células se mantienen vivas algún tiempo en el cultivo, pero no pueden propagarse in vitro. Se denominan líneas celulares o cultivos celulares de línea a los que tras la obtención de las células de un órgano o tejido pueden propagarse posteriormente in vitro.
Existen varios tipos de células de línea, como las de tejidos embrionarios, que sólo permiten alrededor de 50 subcultivos y mueren y las células de tejidos neoplásicos, que se propagan indefinidamente y se denominan líneas celulares continuas, confirmándose este hecho cuando se han propagado durante más de 70 pases.
Los virus o las muestras clínicas se inoculan a estos cultivos celulares. Según el virus que se pretende aislar se utiliza uno u otro sistema celular.
Acción citopática:
Se denomina acción citopática la lesión que causan algunos virus a las células en que se replican.
Las lesiones celulares pueden ser intensas y precoces, produciendo en 24 o 48horas la muerte celular, acompañada de lisis fácilmente observable al inspeccionar los cultivos celulares con un microscopio. En otras ocasiones las alteraciones morfológicas que se producen en las células son mínimas o tardías y muy difíciles de detectar.
En las células infectadas por determinados virus pueden observarse cuerpos de inclusión, acompañando a las alteraciones celulares más o menos importantes. Los cuerpos de inclusión pueden visualizarse, después de la tinción de las células con hematoxilina eritrosina, como masas con morfología más o menos característica y localización nuclear o citoplasmática típica, según los virus que los originan. Están constituidos por acúmulos del material vírico sintetizado depositados en zonas celulares alteradas; en ocasiones predomina o es exclusivo el depósito de material vírico y en otras lo prominente o exclusivo es la lesión celular.
El aspecto particular y característico de cada tipo de inclusión suele orientar sobre el grupo de virus que la produce. La formación de cuerpos de inclusión ocurre tanto in vivo, en las infecciones naturales, como en los cultivos celulares infectados.
Ya se ha señalado que, aparte de la acción citopática directa, la lesión de las células infectadas por un virus puede deberse a la respuesta inmune dirigida contra antígenos codificados por el virus y expresados en la superficie celular.
89693 - Fabiano Lima das Gracas
ResponderEliminarVirologia – Grupo Lunes 10-12pm
3-Reaccion en la Cadena de Polimerasa: (PCR)
Detección de ácidos nucleicos
El método mas utilizado para detección de acidos nucleicos es la Reacción en Cadena de la Polimerasa, PCR, que es una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, que utiliza una ADN polimerasa y oligonucleótidos cebadores, primers, para producir luego de varios ciclos, millones de moléculas del fragmento seleccionado a partir de una sola copia. Los productos de PCR pueden ser detectados por tinción con bromuro de etidio y electroforesis en geles de agarosa.
Esta técnica permite detectar mínimas cantidades de ácidos nucleicos en muestras clínicas y por lo tanto ha significado un gran avance con respecto a los métodos convencionales.
89693 - Fabiano Lima das Gracas
ResponderEliminarVirologia – Grupo Lunes 10-12pm
4-Inoculaciones en el Embrion de Pollo:
Embriones animales:
Los más utilizados son los embriones de pollo (huevos de gallina fecundados). Los huevos fecundados se incuban hasta el momento de su inoculación que suele oscilar entre 6 y 14 días. Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrión, requieren experiencia para su realización. La inoculación en la cavidad amniótica es las más utilizada para el aislamiento de virus a partir de muestras clínicas. Este sistema es el más adecuado para el aislamiento de los virus de la gripe.
89693 - Fabiano Lima das Gracas
ResponderEliminarVirologia – Grupo Lunes 10-12pm
5-Inhibicion de la Hemaglutinacion:
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
89693 - Fabiano Lima das Gracas
ResponderEliminarVirologia – Grupo Lunes 10-12pm
6-ELISA:
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune.
89693 - Fabiano Lima das Gracas
ResponderEliminarVirologia – Grupo Lunes 10-12pm
7-Tecnicas Analiticas de Bloting:
Dot Blot es una técnica de biología molecular para detectar biomoléculas. Representa una simplificación de los métodos Northern blot, Southern blot o Western blot. En un dot blot las biomoléculas para ser detectados no son separadas por cromatografía. En cambio, una gota que contiene la molécula para ser detectada se aplica directamente sobre una membrana. Esto es seguido por la detección por sondas de nucleótidos (northern blot y southern blot) o anticuerpos (para un western blot).
La técnica ofrece importantes ahorros en tiempo. Sin embargo, no ofrece información sobre el tamaño de la biomolécula blanco. Además, si dos moléculas de diferentes tamaños son detectadas, se seguirá viendo como un solo punto. Por lo tanto el dot blot sólo puede confirmar la presencia o ausencia de una biomolécula o biomoléculas que pueden ser detectados por las sondas de ADN o el anticuerpo.
La siguiente imagen ilustra el resultado obtenido de realizar un protocolo dot blot en el que se fijaron muestras de ADN a la membrana, y posteriormente se hibridaron con sondas marcadas radiactivamente específicas de ciertas regiones del ADN de estudio. Solamente las muestras portadoras de la región de interés se revelaron (puntos oscuros). Cuanto mayor es la cantidad del ADN de interés, mayor es la intensidad del color negro. Una muestra radiactiva puede ser hibridada para permitir al investigador
88977
ResponderEliminartema: Diagnostico de la virosis
Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, según persigan demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos específicos por parte del huésped en el curso de la infección.
Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico clínico se basan en pruebas serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas. Sin embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten precozmente la infección viral (tratamientos específicos, medidas profilácticas, etc.).
En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia de antígenos virales previamente al desarrollo de la seroconversión, siendo esta prueba la única evidencia de la exposición al virus cuando no existe aumento de los niveles de anticuerpos circulantes (pacientes inmunodeprimidos).
Igualmente la detección del genoma viral puede favorecer la precocidad del diagnóstico viral y su confirmación. En la última década se han desarrollado una serie de técnicas para el diagnóstico viral basadas en la detección de ácidos nucleicos. De ellas la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más utilizada.
88977
ResponderEliminarcultivo de tejido- efecto citopatico - cuerpos de inclusión
Cultivo de tejidos. Puede definirse como el conjunto de técnicas que permiten el cultivo en condiciones asépticas de órganos, tejidos, células y protoplastos. Constituye dentro de las biotecnologías, la que mayor aporte práctico ha brindado. Sus aplicaciones van desde estudios teóricos sobre fisiología y bioquímica vegetal, hasta la obtención de plantas libres de patógenos, conservación de germoplasma, produccción de metabolitos secuandarios, propagación masiva de plantas, mejoramiento genético, inducción de mutaciones, selección in vitro y desarrollo de protocolos de regeneración de plantas para su utilización en ingeniería genética.
Efecto citopático (CPE)
La presencia del virus con frecuencia implica cambios morfológicos en la célula huésped. Cualquier cambio detectable en la célula huésped provocado por infección se conoce como efecto citopático. Los efectos citopáticos pueden consistir en redondeamiento, desorientación, edematización o encogimiento, muerte, despegamiento de la superficie, etc.
Muchos virus inducen apoptosis (muerte celular programada) en las células infectadas. Esto puede ser parte importante de los mecanismos de defensa antivirales de la célula huésped – la muerte celular antes de completarse en ciclo viral replicativo puede limitar la progenie y la difusión de la infección. (Algunos virus endentecen o previenen la apoptosis – dando a sí mismos más oportunidad de replicar más viriones).
Algunos virus afectan la regulación de la expresión de los genes de la célula huésped, lo que puede tener consecuencias importantes tanto en la habilidad del virus de crecer, como en la célula huésped per se.
Los efectos citopáticos producidos por diferentes virus dependen del virus mismo y de la célula en la que se incorporan. Esto puede ser de utilidad en los laboratorios clínicos de virología par ayudar en la identificación de virus aislados.
cuerpos de inclusión
son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus).
Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
88977
ResponderEliminarReacción en cadena de la polimerasa
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
ResponderEliminar88977
Inoculaciones de pollo
los embriones de pollolos huevos fecundados se incuban hasta el momento de su inoculación que suele oscilar entre 6 y 14 días. Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrión (cavidad amniótica, saco vitelinol etc.).
Inoculación por saco alantoideo
Inoculación en saco amniótico Con colorante: líquido amniótico, cámara de aire
Inoculación en saco amniótico
Inoculación en saco vitelino
Inoculación de membrana corioalantoidea (MCA)Con colorante: membrana corioalantoidea permite cuantificar aquellos grupos virales que producen lesiones localizadasEmbrion de 10-12 días, inoculo de 0.1-0.5ml
88977
ResponderEliminarINHIBICION DE LA HEMAGLUTINACION
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
88977
ResponderEliminarELISA
Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
88977
ResponderEliminarLa técnica de transferencia (blotting)
se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:
Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Christopher Robles
ResponderEliminar2011-0692
Diagnostico de Laboratorio
Slide 1-2, Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped. DIAGNOSTICO VIRAL 1. Métodos para detectar virus. 1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico. • Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple. • Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus. El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares. Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica. Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga). 1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células. 1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
Christopher Robles
ResponderEliminar2011-0692
Slide 2 -Pruebas diagnósticas Inmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%. Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas. Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%. Tiempo de procesamiento de los examenes: La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
Christopher Robles
ResponderEliminar2011-0692
Slide 3, Efecto citopático Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones. Cambios morfológicos Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales. Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral. Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral. Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus). Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
Christopher Robles
ResponderEliminar2011-0692
Slide 4, La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos. Inhibición de Hemaglutinación Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación. Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
Christopher Robles
ResponderEliminar2011-0692
Slide 5, ELISA es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre. Forma en que se realiza el examen La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción. La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente. Preparación para el examen No se necesita ninguna preparación especial. Lo que se siente durante el examen Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil. Razones por las que se realiza el examen Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes. Valores normales Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen. • ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
Christopher Robles
ResponderEliminar2011-0692
Slide 6, La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
# 2012-1270 Diagnóstico de la virosis (2012-1270)
ResponderEliminarEl primer paso para hacer el diagnóstico de la virosis consiste en la observación e identificación de síntomas y signos productos de infecciones por virus. Ante la sospecha de una infección viral, se procede a tomarle muestras al paciente para análisis directo que demuestre la presencia del virus en la muestra o para análisis indirecto mediante la determinación de anticuerpos específicos en el suero. Por el método indirecto se diagnostican infecciones agudas por la presencia de IgM, seroconversión y serorefuerzo e infecciones crónicas por un alza en la IgG y avidez. En cambio, en el análisis directo se detectan componentes estructurales virales o se visualizan partículas virales en las muestras obtenidas de: orina, heces, tracto respiratorio, piel y sangre. Especificamente, el análisis directo se lleva a cabo por microscopia electrónica o se realiza un Western Blot en caso de que se sospeche que el paciente tenga HIV. De igual forma, también se amplifica el DNA mediante PCR.
# 2012-1270 Cultivo de tejidos, efecto citopático y cuerpos de inclusión
ResponderEliminarEl cultivo de tejidos también denominado cultivo celular, conjunto de técnicas para mantener en vida células aisladas o fragmentos de tejido, en un ambiente artificial que permita sus diversas actividades funcionales. Las distintas técnicas usadas tienen algunos elementos básicos en común: la obtención de una muestra de células o de fragmento de tejidos debe ser efectuada en condiciones asépticas para evitar la contaminación del cultivo por parte de bacterias u hongos; hay que respetar las condiciones de temperatura, grado de acidez (pH), presión osmótica y concentración de algún gas, óptimo para el modelo biológico utilizado; también se debe cuidar especialmente la nutrición del cultivo mediante líquidos o medios de cultivo (naturales o sintéticos) renovados a intervalos oportunos. Los medios de cultivo de tejidos más difundidos son soluciones tamponadas de sales inorgánicas, aminoácidos, carbohidratos, bases nitrogenadas y vitaminas, compuestas adecuadamente en base a las características metabólicas de las células del cultivo.
En cambio, el efecto citopático hace referencia a cualquier cambio detectable en la célula huésped provocado por infección. Los efectos citopáticos pueden consistir en redondeamiento, desorientación, edematización o encogimiento, muerte, despegamiento de la superficie, etc.
Muchos virus inducen apoptosis en las células infectadas. Esto puede ser parte importante de los mecanismos de defensa antivirales de la célula huésped – la muerte celular antes de completarse en ciclo viral replicativo puede limitar la progenie y la difusión de la infección.
Algunos virus afectan la regulación de la expresión de los genes de la célula huésped, lo que puede tener consecuencias importantes tanto en la habilidad del virus de crecer, como en la célula huésped per se.
Los efectos citopáticos producidos por diferentes virus dependen del virus mismo y de la célula en la que se incorporan. Esto puede ser de utilidad en los laboratorios clínicos de virología para ayudar en la identificación de virus aislados.
Por último, muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (VIH) y en otros como pequeñas vesículas.
Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (reovirus).
# 2012-1270 Reaccion en cadena de la polimerasa
ResponderEliminarEsta técnica permite multiplicar pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta más de dos mil nucleótidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas.
El método se basa, en su forma más simple en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y cuarenta veces.. La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separación de las dos cadenas que constituyen el ADN, hecho que se conoce como "desnaturalización". En el segundo paso, la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucleótidos (oligonucleóridos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Se trata de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera tal que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar. Obviamente, para que se pueda producir el apareamiento, cada uno de estos oligonucleótidos, a los que se denomina "iniciadores" o primers, debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del ADN molde. En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa desoxidonucleósidos trifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de reacción. La temperatura a la que se realiza el tercer paso está condicionada por aquélla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, apareamiento, extensión) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers. Una vez finalizada la reacción se habrá logrado fabricar, en pocas horas, gran cantidad de un fragmento génico con un alto grado de pureza.
# 2012-1270 Inoculaciones en el embrión de pollo
ResponderEliminarSe han utilizado huevos fecundados para cultivar virus, durante más de 15 años. Un virus en particular, solo puede reproducirse en determinadas partes del huevo. Por consiguiente, se deben inocular, en la región apropiada.
A) Membrana corioalantoidea: para el aislamiento y cultivo de Poxvirus, algunos Mixovirus y ciertos Rhabdovirus, que provocan pustulas visibles. Los embriones son de 10 a 12 días. El inóculo es de 0.1 a 0.5 mL.
B) Embrion: Para aislamiento de virus de la rabia o herpesvirus neurotrópicos, que provocan encefalitis. Los embriones deben ser de 8 a 14 días y el inóculo es de 0.01 a 0.02 mL.
C) Cavidad alantoidea: Se desarrollan bien el virus de la Parotiditis, los de las Encefalomielitis Equina del Oeste, del Este y Venezolana, algunos Paramixovirus y el de la peste aviar. Los embriones deben tener 9 a 12 días y el inóculo es de 0.1 a 0.2 mL.
D) Cavidad amniótica: Para varios tipos de virus. La inoculación en esta cavidad, se realiza para aislar en forma primaria, al virus de la Influenza. Se emplean embriones de 7 a 15 dias y el inoculo es de 0.1 a 0.2mL.
E) Saco vitelino: Virus que causan ETS, ERA y rickettsias. Embriones de 5 a 8 dias e inoculo de 0.2 a 1 mL.
# 2012-1270 Inhibición de la hemoaglutinación
ResponderEliminarLa hemoaglutinación es la habilidad que tienen ciertos virus para unir y aglutinar eritrocitos de mamíferos y aves debido a las proteínas que poseen en su capa externa. Esta hemoaglutinación puede usarse para facilitar la identificación de un virus desconocido.
La actividad enzimàtica de las proteínas virales (hemaglutininas) produce hemaglutinaciòn en la cual los eritrocitos se unen por medio de puentes. Se ha demostrado que el glóbulo rojo contiene cerca de 300 sitios en los cuales se puede adsorber un virus.
Muchos virus contienen proteínas en su capa externa que los capacitan para aglutinar glóbulos rojos de varias especies. Elusión es la liberación del virus. El virus produce elusión sobre el glóbulo rojo a 37° C debido a la destrucción del ácido neuramínico en sus receptores por la neurominidasa del virión. El virus eluido puede aglutinar un glóbulo rojo fresco, pero éste, una vez eluido ya no puede ser aglutinado por la misma especie de virus, debido a la pérdida de sus receptores.
La inhibición de la hemoaglutinación (IHA) es la unión de anticuerpos a la hemoaglutinina del virus.
Las pruebas de IHA constituyen métodos de diagnóstico e investigación sencillos y útiles en la identificación de virus, determinación de la relación antigénica de virus aislados, identificación y cuantificación de anticuerpos contra virus.
Características:
● Pruebas altamente específicas y sensibles.
● Se pueden adaptar fácilmente a laboratorios de escasa infraestructura por el bajo costo de los reactivos.
● Son simples y rápidas.
Hay dos métodos para realizar la IHA, en uno se realizan diluciones decrecientes de virus y se enfrentan a cantidades constantes de suero (alfa) y diluciones decrecientes de suero que se enfrentan a cantidades constantes de virus (beta). El método beta es el más comunmente utilizado
Las pruebas de IHA constituyen métodos de diagnóstico e investigación sencillos y útiles en la:
a. Identificación de virus.
b. Determinación de la relación antigénica entre virus aislados.
c. Identificación y cuantificación de anticuerpos contra virus.
Los inhibidores específicos e inespecíficos actúan inhibiendo competitivamente con los anticuerpos la hemaglutinina del virus. El suero de muchas especies contienen inhibidores inespecíficos o aglutininas inespecíficas que pueden conducir a errores en los resultados, por los que deben ser destruidos antes de realizar una prueba de IHA, para permitir la determinación del nivel de anticuerpos específicos en un suero o para la correcta identificación de un virus aislado.
# 2012-1270 ELISA
ResponderEliminarLa técnica de ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) es utilizada para la detección de muy diversas moléculas biológicas, basándose en la especificidad del reconocimiento antígeno-anticuerpo y en la sensibilidad de las pruebas enzimáticas.
La técnica de ELISA es un ensayo inmunoenzimático ampliamente empleado en el área médica para la cuantificación de moléculas especialmente de aquellas que experimentan cambios en diferentes estados como pueden ser infecciones por bacterias, virus, hongos o parásitos o fases activas de enfermedades autoinmunes. Como ejemplo se pueden medir por ELISA hormonas, autoanticuerpos, inmunoglobulinas contra antígenos de patógenos, toxinas, antígenos. Las técnicas de ELISA son también muy usadas en los ensayos de nuevos medicamentos para comprobar sus efectos cuantificando las moléculas de interés en cada caso. Existen numerosas variantes de este tipo de ensayo. Entre ellos se encuentran los métodos directo e indirecto. El método directo permite la detección del antígeno con un anticuerpo específico conjugado con una enzima como sistema de marcaje. En el método indirecto el antígeno reacciona con el anticuerpo específico. El complejo antígeno-anticuerpo es entonces detectado por un segundo anticuerpo que reconoce dominios constantes de anticuerpos. Este anticuerpo, que suele ser específico de especie, es el que está marcado enzimáticamente. Esto permite que un mismo anticuerpo marcado sea capaz de detectar diferentes antígenos. En ambos métodos, la reacción enzimática puede ser detectada espectrofotográficamente con un lector ELISA.
# 2012-1270 Técnicas analíticas de blotting
ResponderEliminarEl southern blot es un método para sondear la presencia de una secuencia específica de ADN en una muestra de ADN. Muestras de ADN antes o después de la digestión de la enzima de restricción se separan por electroforesis en gel y luego transferidas a una membrana por Blot a través de la acción capilar. La membrana entonces está expuesta a una sonda de ADN etiquetada que tiene una secuencia base de complemento a la secuencia de ADN de interés. Protocolos más originales utilizan etiquetas radiactivas, ahora existen alternativas sin embargo no radiactivos.
En cambio, el northern blot se utiliza para estudiar los patrones de expresión de un tipo específico de la molécula de ARN como comparación relativa entre un conjunto de diferentes muestras de ARN. Es esencialmente una combinación de desnaturalización electroforesis en gel RNA y una mancha. En este proceso de ARN está separado basado en tamaño y es transferido a una membrana que luego es sondeada con un etiquetado como complemento de una secuencia de interés. Los resultados pueden visualizarse a través de una variedad de formas dependiendo de la etiqueta utilizada; Sin embargo, la mayoría como resultado la revelación de bandas que representa el tamaño del ARN detectado en la muestra. La intensidad de estas bandas está relacionada con la cantidad del objetivo del RNA en las muestras analizadas.
Por otro lado, el western blot son anticuerpos contra la mayoría de las proteínas. Se pueden crear inyectando pequeñas cantidades de la proteína en un animal como un ratón, conejos, ovejas o burro (anticuerpos policlonales) o producido en cultivos celulares (anticuerpos monoclonales). Estos anticuerpos pueden utilizarse para una variedad de técnicas analíticas y preparativos.
En western Blot, las proteínas en primer lugar se separan por tamaño en un gel fino entre dos placas de vidrio (SDS-PAGE). Las proteínas en el gel luego son transferidas a un PVDF, nitrocelulosa, nylon o otro membrana de soporte que puede ser sondeada con soluciones de anticuerpos. Estos se unen a la proteína de interés y pueden visualizarse por una variedad de técnicas, incluyendo productos coloreados, quimioluminiscencia o autorradiografía. A menudo, los anticuerpos están etiquetados con enzimas y se detectan cuando son expuestos a sustratos quimioluminiscentes. Utilizando técnicas occidentales Blot permite no sólo la detección, sino también el análisis cuantitativo. Se detecta la modificación post-translacional de las proteínas.
Wladimir A. Rijo Inirio 89257
ResponderEliminarD# 1(DIAGNÓSTICO DE LAS VIROSIS)
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL
1. Métodos para detectar virus.
1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus.
• Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus.
• Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.
• Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga).
1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células.
1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
Wladimir A. Rijo Inirio 89257
ResponderEliminarD# 2(Pruebas diagnósticas)
Inmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%.
Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas.
Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%.
Tiempo de procesamiento de los examenes:
La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
Wladimir A. Rijo Inirio 89257
ResponderEliminarD# 3 (Efecto citopático)
Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.
Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral.
Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus).
Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
Wladimir A. Rijo Inirio 89257
ResponderEliminarD# 4
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Wladimir A. Rijo Inirio 89257
ResponderEliminarD# 5
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
Wladimir A. Rijo Inirio 89257
ResponderEliminarD# 6
Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen
La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
Preparación para el examen
No se necesita ninguna preparación especial.
Lo que se siente durante el examen
Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil.
Razones por las que se realiza el examen
Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Valores normales
Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen.
• ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
Wladimir A. Rijo Inirio 89257
ResponderEliminarD# 7
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:
Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda.
1.Diagnóstico de virosis
ResponderEliminarEl diagnóstico virológico comprende la detección e identificación del agente etiológico de una infección viral, clínica o inaparente, y /o de la respuesta inmune específica del huésped.
El paciente es puesto bajo observacion para analizar signos y sintomas de la manifestacion de infecciones virales tipicas. Se toma muestra de sangre del paciente para analizar en sus celulas efectos citopaticos y antigenos virales. El metodo o tecnica de microscopia electronica es utilizado para ver los viruses directamente. Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico clínico se basan en pruebas serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas. Sin embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten precozmente la infección viral (tratamientos específicos, medidas profilácticas, etc.). En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia de antígenos virales previamente al desarrollo de la seroconversión, siendo esta prueba la única evidencia de la exposición al virus cuando no existe aumento de los niveles de anticuerpos circulantes (pacientes inmunodeprimidos).
Aplicaciones-En salud pública se utiliza habitualmente en programas de vigilancia epidemiológica (ej: poliomielitis, influenza, hantavirus, VIH, etc.) y en el control de vacunas mediante censos serológicos, como polio, parotiditis y sarampión. En medicina curativa la necesidad del diagnóstico virológico alcanza a todas las disciplinas: pediatría, obstetricia, medicina, cirugía, dermatología, etc. El aumento
de la población de inmunocomprometidos ha creado nuevos problemas por la aparición de cuadros clínicos atípicos y la emergencia de nuevas cepas microbianas. El gran desarrollo de las técnicas de diagnóstico virológico ha permitido ofrecer actualmente una ayuda directa al médico clínico y ha facilitado la investigación en salud, posibilitado su aplicación en muchos campos. Actualmente el médico clínico puede tratar con nuevos antivirales y controlar el curso de muchas infecciones virales, como SIDA, hepatitis B o C, etc. En el presente existe comercialmente una gran variedad de técnicas que pueden implementarse en laboratorios clínicos, por lo que se requiere conocer sus características para
seleccionar las de mayor aplicabilidad.
2.Cultivo de tejidos, efecto citopatico y cuerpos de inclusion
ResponderEliminarCultivo de tejidos o cultivo in vitro- surgió como una técnica de reproducción sin ningún tipo de contaminación en condiciones estériles cuando se buscaba mejorar los productos vegetales y animales. Esta técnica consiste en tomar unas pocas células ubicadas en un segmento pequeño de tejido y regenerar en poco tiempo miles o millones de organismos con las mismas características del tejido original. Esta investigación en cultivo de tejidos puede conseguir muchos avances en la investigación sobre los procesos bioquímicos y morfológicos de la diferenciación celular, en el desarrollo de tecnologías para la propagación clonal o en el mejoramiento genético de plantas o animales.
Efecto citopatico- cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones. Hay cambios morfológicos y lisis cellular que es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.
Cuerpos de inclusión -son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus).
Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
3.PCR
ResponderEliminarLa reacción en cadena de la polimerasa o PCR, es una técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN. Uno de los aportes fundamentales de esta metodología a la investigación básica en biología molecular consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante las cuales se realiza una tarea que antes requería largas y tediosas jornadas. El producto que se obtiene al finalizar la reacción -una gran cantidad de un fragmento génico con alto grado de pureza, favorece la tarea de los investigadores empeñados en ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y función de los genes. Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificación de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el análisis de muestras del niño y de su abuela materna. Entre las aplicaciones médicas de la PCR cabe destacar su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico. Permite detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Ha sido aplicada, por ejemplo, para diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recién nacidos de madres seropositivas, pues la existencia de anticuerpos maternos impide obtener resultados confiables, con los métodos convencionales, durante el primer año de vida. También ha facilitado el diagnóstico de enfermedades tales como las hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis quística, e hizo posible reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológ icas. Su sensibilidad permite detectar poblaciones residuales de células cancerosas en pacientes sometidos a quimioterapia y de este modo se ha podido determinar, con una antelación en extremo valiosa, un nuevo avance de la enfermedad. Existen ya modos de evaluar a través de la PCR el riesgo de padecer dolencias tales como diabetes de tipo I y la enfermedad celiaca.
4.Inoculaciones en el Embrion de Pollo:
ResponderEliminarEn las inoculaciones animals, los más utilizados son los embriones de pollo (huevos de gallina fecundados). Los huevos fecundados se incuban hasta el momento de su inoculación que suele oscilar entre 6 y 14 días. Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrión, requieren experiencia para su realización. La inoculación en la cavidad amniótica es las más utilizada para el aislamiento de virus a partir de muestras clínicas. Este sistema es el más adecuado para el aislamiento de los virus de la gripe.
5.ELISA
ResponderEliminarEs el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la técnica.
2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antígeno, el exceso dará lugar a una reacción falsa negativa.
3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubación para evitar la aparición de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo y el color no será evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo antígeno-anticuerpo tampoco se completará en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las proteínas (antígeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos.
4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.
6.Inhibicion de Hemaglutinacion
ResponderEliminarLa inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígenopor el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
7.Técnica de transferencia (blotting)
ResponderEliminarSe basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:
Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda.
889000
ResponderEliminarD# 1(DIAGNÓSTICO DE LAS VIROSIS)
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL
1. Métodos para detectar virus.
1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus.
• Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus.
• Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.
• Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga).
1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células.
1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
88900
ResponderEliminarD# 2(Pruebas diagnósticas)
Inmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%.
Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas.
Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%.
Tiempo de procesamiento de los examenes:
La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
88900
ResponderEliminarD# 4
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
D# 3 (Efecto citopático)
ResponderEliminarSe denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.
Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral.
Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus).
Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
88900 yosaira bernard m
ResponderEliminarD# 5
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
889000 YOSIARA BERNARD M
ResponderEliminarD6.Inhibicion de Hemaglutinacion
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígenopor el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
88900 yosaira bernard m
ResponderEliminarD# 7
La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:
Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda.
89348 DIAPOSITIVA # 1
ResponderEliminarDIAGNÓSTICO DE LAS VIROSIS
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL
Métodos para detectar virus.
Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus.
• Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus.
• Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.
• Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga).
Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células.
Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
Inmunofluorescencia directa, utilizando células del paciente, como leucocitos, orina o mucosa oral o genital, para buscar virus.
DIAPOSITIVA # 2
ResponderEliminar2-Cultivo de tejidos, Efecto Citopaticos y Cuerpos de Inclusion:
Cultivos celulares:
Se denomina cultivo celular a la multiplicación y mantenimiento de células in vitro
Las células se obtienen de un fragmento de un órgano como el riñón, el pulmón u otros, por trituración y posterior disgregación con tripsina, lo que permite obtener células aisladas que se introducen en frascos con medios de cultivo adecuados. Los cultivos celulares, por tanto, están formados por células disgregadas que han perdido su organización tisular, a diferencia de los cultivos de tejidos u órganos en que se conserva esa estructura.
Las células en los frascos pueden estar en suspensión, es decir, libres en el medio de cultivo líquido o adosadas a la pared del frasco, como unas baldosas, y bañadas por el medio. En el primer caso se trata de células en suspensión y en el segundo en monocapa.
Se denomina cultivo celular primario en suspensión o monocapa, al obtenido a partir de las células normales de un órgano de un animal adulto. Estas células se mantienen vivas algún tiempo en el cultivo, pero no pueden propagarse in vitro. Se denominan líneas celulares o cultivos celulares de línea a los que tras la obtención de las células de un órgano o tejido pueden propagarse posteriormente in vitro.
Existen varios tipos de células de línea, como las de tejidos embrionarios, que sólo permiten alrededor de 50 subcultivos y mueren y las células de tejidos neoplásicos, que se propagan indefinidamente y se denominan líneas celulares continuas, confirmándose este hecho cuando se han propagado durante más de 70 pases.
Los virus o las muestras clínicas se inoculan a estos cultivos celulares. Según el virus que se pretende aislar se utiliza uno u otro sistema celular.
Acción citopática:
Se denomina acción citopática la lesión que causan algunos virus a las células en que se replican.
Las lesiones celulares pueden ser intensas y precoces, produciendo en 24 o 48horas la muerte celular, acompañada de lisis fácilmente observable al inspeccionar los cultivos celulares con un microscopio. En otras ocasiones las alteraciones morfológicas que se producen en las células son mínimas o tardías y muy difíciles de detectar.
En las células infectadas por determinados virus pueden observarse cuerpos de inclusión, acompañando a las alteraciones celulares más o menos importantes. Los cuerpos de inclusión pueden visualizarse, después de la tinción de las células con hematoxilina eritrosina, como masas con morfología más o menos característica y localización nuclear o citoplasmática típica, según los virus que los originan. Están constituidos por acúmulos del material vírico sintetizado depositados en zonas celulares alteradas; en ocasiones predomina o es exclusivo el depósito de material vírico y en otras lo prominente o exclusivo es la lesión celular.
El aspecto particular y característico de cada tipo de inclusión suele orientar sobre el grupo de virus que la produce. La formación de cuerpos de inclusión ocurre tanto in vivo, en las infecciones naturales, como en los cultivos celulares infectados.
Ya se ha señalado que, aparte de la acción citopática directa, la lesión de las células infectadas por un virus puede deberse a la respuesta inmune dirigida contra antígenos codificados por el virus y expresados en la superficie celular.
89348 DIAPOSITIVA 3
ResponderEliminarD# 3 (Efecto citopático)
Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.
Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral.
Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus).
Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
89348 Diapositiva#4
ResponderEliminarInoculaciones en el embrion del pollo
La inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida.
Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos.
Inhibición de Hemaglutinación
Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación.
Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
89348 DIAPOSITIVA # 5
ResponderEliminar.ELISA
Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la técnica.
2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antígeno, el exceso dará lugar a una reacción falsa negativa.
3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubación para evitar la aparición de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo y el color no será evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo antígeno-anticuerpo tampoco se completará en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las proteínas (antígeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos.
4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.
89348 DI8APOSITIVA 6
ResponderEliminarEs el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre.
Forma en que se realiza el examen
La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción.
La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente.
Preparación para el examen
No se necesita ninguna preparación especial.
Lo que se siente durante el examen
Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil.
Razones por las que se realiza el examen
Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes.
Valores normales
Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen.
• ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
89348 DIAPOSITIVA # 7
ResponderEliminar.Técnica de transferencia (blotting)
Se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:
Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar
Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
2012-0276
ResponderEliminarLos virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped. DIAGNOSTICO VIRAL 1. Métodos para detectar virus. 1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico. • Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus. • Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus. • Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple. • Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus. El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares. Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica. Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga). 1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células. 1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
2012-0276
ResponderEliminarPruebas diagnósticas Inmunofluorescencia Directa (IFD): detecta virus Influenza A o B mediante anticuerpos fluorescentes, con sensibilidad de 80%. Cultivo en shell vial de virus Influenza A y B: Se realiza un aislamiento viral, con sensibilidad de 95-100%. Permite además la subtipificación de hemaglutininas y neuraminidasas. Directigen, Influenza A y B(Formato tipo test pack): detecta virus Influenza A y Bmediante EIA con sensibilidad 70-95%. Tiempo de procesamiento de los examenes: La IFD y el Test Pack se informan durante el dia. El cultivo en shell vial se demora 48 horas.
Efecto citopático Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones. Cambios morfológicos Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales. Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral. Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral. Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus). Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
2012-0276
ResponderEliminarLa inhibición de la aglutinación de eritrocitos recubiertos de antígeno por el antígeno homólogo, es un método muy sensible y específico para detectar pequeñas cantidades de antígeno soluble en la sangre u otros líquidos tisulares. El principio de este análisis es que el anticuerpo preincubado con antígenos homólogos solubles o de reacción cruzada, será “inactivado” cuando se incube con eritrocitos recubiertos de antígeno. Así, la prueba se lleva a cabo en dos etapas. El anticuerpo en una concentración relativamente baja, se incuba con una muestra del antígeno de cantidad desconocida. Después de su combinación con antígeno soluble, se añaden las células recubiertas de antígeno y aglutinan por medio de anticuerpo libre o no combinado. ( El grado de inhibición de la aglutinación refleja la cantidad de antígeno presente en la muestra original). Se deberán emplear los controles que abarcan muestras de concentración conocida de antígeno, y eritrocitos no cubiertos. Inhibición de Hemaglutinación Es una prueba que deriva de la habilidad de algunos virus de adherirse a receptores de eritrocitos y aglutinarios (hemaglutinación). La unión de estos virus a los blóbulos rojos puede bloquearse utilizando anticuerpos específicos para los virus y de esta forma se logra la inhibición de la hemaglutinación. Se trata, al contrario de la hemaglutinación de una prueba inmunológica. El anticuerpo o inhibidor específico se asocia al antígeno (virus) inhabilitándolo para adherirse al eritrocito que se agregará posteriormente para revelar.
ELISA Es el acrónimo en inglés para enzimoinmuno análisis de adsorción y es un examen de laboratorio comúnmente usado para detectar anticuerpos en la sangre. Forma en que se realiza el examen La sangre se extrae típicamente de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. Esto se denomina venopunción. La muestra se envía a un laboratorio donde se vincula el anticuerpo o antígeno objeto de estudio a una enzima. Si la sustancia a estudiar está presente en la muestra, la solución de la prueba se torna de un color diferente. Preparación para el examen No se necesita ninguna preparación especial. Lo que se siente durante el examen Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil. Razones por las que se realiza el examen Este examen a menudo se usa para ver si usted ha estado expuesto a virus u otras sustancias que causen infección. Con frecuencia, se emplea para detectar infecciones pasadas o presentes. Valores normales Los valores normales dependen del tipo de sustancia que se esté identificando. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen. • ELISA ''sándwich'' (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
2012-0276
ResponderEliminarLa técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
yessenia severino sanchez mat:89206
ResponderEliminarDIAGNÓSTICO DE LAS VIROSIS
Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una envoltura, el tamaño del virus y el huésped.
DIAGNOSTICO VIRAL
1. Métodos para detectar virus.
1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus. La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal, amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de experimentación es excepcional en el diagnóstico.
• Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus, paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus.
• Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus, picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus.
• Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.
• Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA ) de la inmunodeficiencia, el coxsackie A y los togavirus.
El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincicios y existen cuerpos de inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares.
Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de importancia clínica.
Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas, como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej los picornavirus no pueden replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina interferencia heteróloga).
Cultivo de tejidos vegetales
Cultivo in-vitro de tejidos de Physcomitrella patens en placas de Petri con agar.
En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.
Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.
yessenia severino sanchez mat:89204
ResponderEliminarEfecto citopático
Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y orgánulos celulares sufren alteraciones drásticas a nivel molecular, muchas de las cuales tienen manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones.
Cambios morfológicos
Lisis: La lisis celular es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.
Inicialmente se producen alteraciones en la funcionalidad de membrana, seguidos de cambios en la morfología del núcleo y de la desorganización de ciertos orgánulos y del citoesqueleto, lo cual provoca la pérdida de adherencia al sustrato (uniones focales) y el redondeamiento celular ya mencionados. La observación a microscopía electrónica reporta información más exhaustiva y detallada, sobre las alteraciones morfológicas a nivel ultraestructural. Los picornavirus, por ejemplo, provocan la desorganización del aparato de Golgi, bloqueando el tráfico vesicular, y alteraciones en la morfología del núcleo, que se torna lobulado y es desplazado a la periferia celular. El virus de la polio, en un cultivo de células HeLa (el primer sistema en el que se observó efecto citopático), provoca en un corto período la deformación del núcleo y la desorganización del citoesqueleto y el sistema vesicular, apareciendo característicamente un gran número de vesículas membranosas, que llegan a ocupar la mayor parte del citoplasma en estadios tardíos de infección. Dichas vesículas tienen entre 50-200 nm y son necesarias para la replicación del genoma viral.
Cuerpos de inclusión: Muchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas (e.g. VIH) y en otros como pequeñas vesículas. En varios virus se ha comprobado que estas regiones corresponden a zonas muy ricas en proteínas virales, siendo centros de replicación viral.
Los cuerpos de inclusión son estructuras observables a microscopía óptica y constituyen centros activos del ciclo vírico intracelular. Corresponden a complejos replicativos, transcripcionales o de ensamblaje; situados en el núcleo (e.g. herpesvirus β, virus del sarampión y adenovirus) o en el citoplasma, asociados al citoesqueleto (e.g. reovirus).
Tienen valor diagnóstico, ya que poseen carácter basófilo o acidófilo (eosinófilo) según el virus.
Reacción en cadena de la polimerasa
Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad.
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad.